2021 Fiscal Year Research-status Report
採取容易な検体を用いたクロイツフェルト・ヤコブ病早期診断法の確立
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20K07807
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
森 剛志 宮崎大学, 医学部, 助教 (40426565)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 克也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(保健学科), 教授 (70398147)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | プリオン病 / QUIC法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
致死性の神経変性疾患であるプリオン病は、現時点において有効な治療法や早期診断法は存在しない。近年開発された異常型プリオン蛋白（PrP）試験管内増幅法（RT-QUIC法）はプリオン病罹患者の脳や髄液中に含まれる異常型PrPを検出可能とした高感度アッセイ系である。本研究では、プリオン病の早期診断を目標に、さらに微量の異常型PrPを検出する発展型RT-QUIC法を構築する。大量試料や高濃度試料から微量存在する異常型PrPを濃縮し、RT-QUIC法の感度を上げることで初期症状患者の診断を可能とする。RT-QUIC法は、他成分を多く含む高濃度試料からの微量異常型PrP検出を苦手とする。高濃度試料はQUIC反応を阻害するため、ここでは様々なビーズを用いて異常型PrPを他成分より分離し、その試料（濃縮PrP）を用いたRT-QUIC法を構築する。
前年度は様々なビーズを用いて本研究遂行が可能か、どの素材が有効かを検討した。PBS(-)に段階希釈したプリオン発症脳乳剤を晒したビーズを用いてRT-QUIC法を試みた。インキュベートした各々のビーズはリンス後、RT-QUIC法に用いたところ、数種のビーズにて偽陽性が観察された。
令和３年度は課題であった偽陽性を抑える条件を決定した。最適ビーズ、温度、組成や回転条件を変更することで最適条件を検討した。また、高濃度他成分サンプルや血液成分の代替え実験として高濃度のFBSを用いた。ビーズはFBSに段階希釈したプリオン発症脳乳剤（クロイツフェルト・ヤコブ病罹患者脳乳剤）とインキュベートさせ、一度リンスした後RT-QUIC法を行ったところ、高濃度のFBS存在下でもQUIC反応が得られた。またこれらの検出感度は若干の蛍光強度減少がみられたがビーズ有無におけるシード活性に大差はみられなかった。現在、安価なメタルパウダーがビーズ等の代替となりうるかを検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、「ヒト検体を用いたB-QUIC法の検出限界値」を決定させることを目標としてきた。様々な金属ビーズを用いて、偽陽性の出現を抑える最適ビーズ、温度、回転条件を検討した。また、従来のRT-QUIC法との検出感度を比較するために、プリオンシード活性既知の脳乳剤（クロイツフェルト・ヤコブ病罹患者脳乳剤）を添加した希釈サンプルをビーズと反応させた。脳乳剤の段階希釈にはPBS(-)にて希釈した牛胎児血清FBS等を用いた。反応させたビーズは一度リンスし、QUIC反応させたところ、高濃度のFBSで希釈した脳乳剤においても陽性反応を示し、また、その検出感度は従来のRT-QUIC法と大きな差はみられなかった。FBS内懸濁ヒトプリオンシードを検出できたことから、今後はビーズによりどのくらいの量の試料から濃縮できるかを検討する。また、安価であるメタルパウダーがビーズの代替となりうるかを検討しているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は牛胎児血清FBSにヒトプリオンシードを段階希釈し、B-QUIC方が可能かを検討した。令和４年度はFBSの量を増やし、どのくらいの量からシードを濃縮できるのか検討する。段階希釈された脳乳剤は様々な量のFBSに懸濁し、ビーズとインキュベートする。これらビーズをRT-QUIC法に用いることで、どのくらいまで試料が増えても濃縮が可能かを検討する。また、クロイツフェルト罹患者の髄液、血清、尿等を用いてB-QUIC法を試み、試料中にシードが存在するのか、また、B-QUIC法によりそれが検出可能かを検討する。
また、本研究課題内容には「レビー小体型認知症DLB患者検体への応用、ビーズを用いたRT-QUIC（B-QUIC法）のプリオン病以外でも有用かを検討する」があるが現時点で当研究室でのDLB罹患脳乳剤を用いたαシヌクレインRT-QUIC法が安定していないため、まずは従来のαシヌクレインRT-QUIC法の安定化を目指す。
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| Causes of Carryover |
本研究では、RT-QUIC法の基質として多くリコンビナント蛋白を要する。令和３年度に購入予定であったNi-NTAスーパーフローアガロースはそれらリコンビナント蛋白の精製に必須であるが、現時点においては僅かながら当研究室にリコンビナント蛋白のストックがあったことから、今年度は購入しなかった。今後、本研究を遂行する上でさらに多くのリコンビナント蛋白を必要となるため、次年度購入することに変更した。
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Research Products
(2 results)
