ロングリードシーケンサーを用いた新規てんかん原因遺伝子の探索

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08164
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 水口 剛 横浜市立大学, 医学部, 講師 (90404996)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ロングリードシークエンサー / てんかん / Structural variant / 遺伝要因 / リピート病

Outline of Annual Research Achievements

本課題ではロングリードシーケンサーを駆使した疾患ゲノム解析法を確立し希少疾患の新たな遺伝要因を明らかにすることを目指している。現在までにロングリードシーケンス解析が抱える2つの問題点の克服に取り組んだ。
①病的変化を抽出するためのゲノム情報解析系の確立
ロングリードシーケンサーは20,000 bp以上の長いDNA配列を一本のリードで解読することで、既存の解析法で検出が難しい種類・サイズの病的変異、複雑な染色体構造異常の全体像を明らかにすることが可能である。しかし1人あたり約27,000個の膨大なゲノム構造変化（SV: Structural variant）が検出されるため、病的意義のあるゲノム変化をいかに効率よく抽出するかが課題であった。そこでリピート病を解析モデルとした解析を行い、変異情報の効果的な絞り込みにより膨大なデータの中から目的とする病的リピート伸長変異を抽出可能であることを示した。構築したゲノム解析系をエクソーム解析で原因遺伝子変異が未同定の症例の解析に応用した。
②“ロングリード”と“高精度”を両立させる解析系の確立
ロングリードシークエンサーから出力されるデータはエラーが多いため、一塩基の精度で正確な配列を知ることは困難である。そこで、解析したい標的領域のDNA断片を選択的に濃縮し、標的領域を繰り返しシーケンスすることで、正確性の高いコンセンサス配列を決定することに成功した（選択的濃縮法）。また一分子由来の環状構造DNAを繰り返しシーケンスすることでエラー補正を行うcircular consensus sequencing (CCS) 法を確立し、未診断症例の全ゲノム解析に応用した。現行の遺伝学的検査は標的変異の種類・サイズに応じて最適な解析法が異なるが、CCS法による全ゲノム解析を行うことで、多様な遺伝的変化を1回の実験で網羅的に評価することを目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前述のゲノム情報解析系を未診断症例に応用し、従来法で明らかにすることが出来なかった病的ゲノム欠失や逆位を明らかにすることができた[Mizuguchi T et al. Genomics. 113:1044-1053. 2021]。これらの病的変異はGCリッチ、リピート配列に特徴づけられるゲノム難読領域に位置し, ロングリードを用いることで初めて検出可能であった。また選択的濃縮法を用いることで、てんかんの原因となるSAMD12遺伝子のリピート伸長変異の全長配列を決定し、伸長変異の多様性を明らかにすることができた[Mizuguchi T et al. Brain. 144: 1103-1117. 2021]。選択的濃縮法による標的領域の高精度解析に加えて、高精度全ゲノムロングリード解析を目標にCCS法の構築に取り組んだ。CCS法のデータは極めて高精度で、構造異常切断点の正確なマッピングや一塩基バリアント (SNV: single nucleotide variant) 解析に有用であることを確認できた[Mizuguchi T et al. Genomics. 113:1044-1053. 2021]。

Strategy for Future Research Activity

これまではロングリードの特徴を最大限に活かせるStructural variants (SVs)とリピート伸長変異に特化して解析を行ってきた。実際、未診断症例の一部は、これら大きいサイズのゲノム変化により引き起こされていた。しかしそれでも、希少遺伝性疾患の半数以上は疾患原因が未同定である。現在、SNVの解析はショートリードシーケンサーが主流となっているが、短いリード長（150 bp程度）のショートリード解析ではゲノム難読領域に存在するSNVを評価できていない。そこで今後、ロングリード解析のターゲットをSNVに広げていく予定である。またロングリード解析ではPCRフリーの調製法により塩基修飾をシーケンス時に直接読み取ることが可能で、新たなエピゲノム解析法としての可能性を秘めている。今後は上述のゲノム異常に加えてエピジェネティックスの破綻により発症する疾患を解析するため、ロングリードメチローム解析系の構築を目指す。

Causes of Carryover

本年度は予備実験により得られていたデータを使用したデータ解析系の構築を中心に研究を推進したことから実験試薬の購入に未使用額が生じた。当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、研究の進捗状況を鑑みて必要に応じた物品購入の執行を行う予定である。

Research Products

• [Journal Article] Prenatal clinical manifestations in individuals with COL4A1/2 variants (2021)
  • Author(s): Itai Toshiyuki、Miyatake Satoko、Taguri Masataka、others、Mizuguchi Takeshi、Takata Atsushi、Miyake Noriko、Tsurusaki Yoshinori、Doi Hiroshi、Nakashima Mitsuko、Saitsu Hirotomo、Matsumoto Naomichi
  • Journal Title: Journal of Medical Genetics Volume: 58 Pages: 505～513
  • DOI: 10.1136/jmedgenet-2020-106896
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Long-read whole-genome sequencing identified a partial MBD5 deletion in an exome-negative patient with neurodevelopmental disorder (2021)
  • Author(s): Ohori Sachiko、Tsuburaya Rie S.、Kinoshita Masako、Miyagi Etsuko、Mizuguchi Takeshi、Mitsuhashi Satomi、Frith Martin C.、Matsumoto Naomichi
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 66 Pages: 697～705
  • DOI: 10.1038/s10038-020-00893-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Complete sequencing of expanded SAMD12 repeats by long-read sequencing and Cas9-mediated enrichment (2021)
  • Author(s): Mizuguchi Takeshi、Toyota Tomoko、Miyatake Satoko、others、Matsumoto Naomichi
  • Journal Title: Brain Volume: 144 Pages: 1103～1117
  • DOI: 10.1093/brain/awab021
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Whole exome sequencing of fetal structural anomalies detected by ultrasonography (2021)
  • Author(s): Aoi Hiromi、Mizuguchi Takeshi、Suzuki Toshifumi、others、Matsumoto Naomichi
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 66 Pages: 499～507
  • DOI: 10.1038/s10038-020-00869-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Diverse Pathological Findings of Interstitial Lung Disease in a Patient with Dyskeratosis Congenita (2021)
  • Author(s): Otoshi Ryota、Baba Tomohisa、Shintani Ryota、Kitamura Hideya、Yamaguchi Yukie、Hamanoue Haruka、Mizuguchi Takeshi、Matsumoto Naomichi、Okudela Koji、Takemura Tamiko、Ogura Takashi
  • Journal Title: Internal Medicine Volume: 60 Pages: 1257～1263
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.5143-20
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel EXOSC9 variants cause pontocerebellar hypoplasia type 1D with spinal motor neuronopathy and cerebellar atrophy (2021)
  • Author(s): Sakamoto Masamune、Iwama Kazuhiro、Sekiguchi Futoshi、Mashimo Hideaki、Kumada Satoko、Ishigaki Keiko、Okamoto Nobuhiko、Behnam Mahdiyeh、Ghadami Mohsen、Koshimizu Eriko、Miyatake Satoko、Mitsuhashi Satomi、Mizuguchi Takeshi、Takata Atsushi、Saitsu Hirotomo、Miyake Noriko、Matsumoto Naomichi
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 66 Pages: 401～407
  • DOI: 10.1038/s10038-020-00853-2
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pathogenic 12-kb copy-neutral inversion in syndromic intellectual disability identified by high-fidelity long-read sequencing (2021)
  • Author(s): Mizuguchi T, Okamoto N, Yanagihara K, Miyatake S, Uchiyama Y, Tsuchida N, Hamanaka K, Fujita A, Miyake N and Matsumoto N
  • Journal Title: Genomics Volume: 113 Pages: 1044-1053
  • DOI: 10.1016/j.ygeno.2020.10.038
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficient detection of copy-number variations using exome data: Batch- and sex-based analyses (2021)
  • Author(s): Uchiyama Y, Yamaguchi D, Iwama K, others, Mizuguchi T and Matsumoto N
  • Journal Title: Hum Mutat Volume: 42 Pages: 50-65
  • DOI: 10.1002/humu.24129
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ATP1A3 variants and slowly progressive cerebellar ataxia without paroxysmal or episodic symptoms in children (2021)
  • Author(s): Sasaki M, Sumitomo N, Shimizu-Motohashi Y, Takeshita E, Kurosawa K, Kosaki K, Iwama K, Mizuguchi T and Matsumoto N
  • Journal Title: Dev Med Child Neurol Volume: 63 Pages: 111-115
  • DOI: 10.1111/dmcn.14666
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] OTUD5 Variants Associated With X-Linked Intellectual Disability and Congenital Malformation (2021)
  • Author(s): Saida K, Fukuda T, Scott D A, Sengoku T, Ogata K, Nicosia A, Hernandez-Garcia A, Lalani S R, Azamian M S, Streff H, Liu P, Dai H, Mizuguchi T, Miyatake S, Asahina M, Ogata T, Miyake N and Matsumoto N
  • Journal Title: Front Cell Dev Biol Volume: 9 Pages: 631428
  • DOI: 10.3389/fcell.2021.631428
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Novel ACOX1 mutations in two siblings with peroxisomal acyl-CoA oxidase deficiency (2021)
  • Author(s): Morita A, Enokizono T, Ohto T, Tanaka M, Watanabe S, Takada Y, Iwama K, Mizuguchi T, Matsumoto N, Morita M, Takashima S, Shimozawa N and Takada H
  • Journal Title: Brain Dev Volume: 43 Pages: 475-481
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.10.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical variations of epileptic syndrome associated with PACS2 variant (2021)
  • Author(s): Mizuno T, Miyata R, Hojo A, Tamura Y, Nakashima M, Mizuguchi T, Matsumoto N and Kato M
  • Journal Title: Brain Dev Volume: 43 Pages: 343-347
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.10.006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] De novo ATP1A3 variants cause polymicrogyria (2021)
  • Author(s): Miyatake S, Kato M, Kumamoto T, others, Mizuguchi T, Miyake N, Suzuki A, Ohga S, Saitsu H, Takahashi H, Tanaka F, Ogata K, Ohtaka-Maruyama C and Matsumoto N
  • Journal Title: Sci Adv Volume: 7 Pages: -
  • DOI: 10.1126/sciadv.abd2368
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] De novo variants in CELF2 that disrupt the nuclear localization signal cause developmental and epileptic encephalopathy (2021)
  • Author(s): Itai T, Hamanaka K, Sasaki K, others, Mizuguchi T, Takata A, Miyake N, Takahashi H, Miyagi E, Tsurusaki Y, Doi H, Taguri M, Antonarakis S E, Nakashima M, Saitsu H, Miyatake S and Matsumoto N
  • Journal Title: Hum Mutat Volume: 42 Pages: 66-76
  • DOI: 10.1002/humu.24130
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mutation-specific pathophysiological mechanisms define different neurodevelopmental disorders associated with SATB1 dysfunction (2021)
  • Author(s): den Hoed J, de Boer E, Voisin N, others, Mizuguchi T, others, Fisher S E and Vissers L
  • Journal Title: Am J Hum Genet Volume: 108 Pages: 346-356
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2021.01.007
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ATP6V0A1 encoding the a1-subunit of the V0 domain of vacuolar H(+)-ATPases is essential for brain development in humans and mice (2021)
  • Author(s): Aoto K, Kato M, Akita T, Nakashima M, Mutoh H, Akasaka N, Tohyama J, Nomura Y, Hoshino K, Ago Y, Tanaka R, Epstein O, Ben-Haim R, Heyman E, Miyazaki T, Belal H, Takabayashi S, Ohba C, Takata A, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Fukuda A, Matsumoto N and Saitsu H
  • Journal Title: Nat Commun Volume: 12 Pages: 2107
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22389-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] KCNT1-positive epilepsy of infancy with migrating focal seizures successfully treated with nonnarcotic antitussive drugs after treatment failure with quinidine: A case report (2020)
  • Author(s): Takase C, Shirai K, Matsumura Y, Watanabe T, Watanabe A, Hirasawa-Inoue A, Mizuguchi T, Matsumoto N, Sugai K and Hayashi M
  • Journal Title: Brain Dev Volume: 42 Pages: 607-611
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.05.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cerebrospinal fluid abnormalities in developmental and epileptic encephalopathy with a de novo CDK19 variant (2020)
  • Author(s): Sugawara Y, Mizuno T, Moriyama K, Ishiwata H, Kato M, Nakashima M, Mizuguchi T and Matsumoto N
  • Journal Title: Neurol Genet Volume: 6 Pages: e527
  • DOI: 10.1212/NXG.0000000000000527
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel ITPA variant causes epileptic encephalopathy with multiple-organ dysfunction (2020)
  • Author(s): Sakamoto M, Kouhei D, Haniffa M, Silva S, Troncoso M, Santander P, Schonstedt V, Stecher X, Okamoto N, Hamanaka K, Mizuguchi T, Mitsuhashi S, Miyake N and Matsumoto N
  • Journal Title: J Hum Genet Volume: 65 Pages: 751-757
  • DOI: 10.1038/s10038-020-0765-3
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Neuronal intranuclear inclusion disease presenting with an MELAS-like episode in chronic polyneuropathy (2020)
  • Author(s): Ishihara T, Okamoto T, Saida K, Saitoh Y, Oda S, Sano T, Yoshida T, Morita Y, Fujita A, Fukuda H, Miyake N, Mizuguchi T, Saito Y, Sekijima Y, Matsumoto N and Takahashi Y
  • Journal Title: Neurol Genet Volume: 6 Pages: e531
  • DOI: 10.1212/NXG.0000000000000531
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hemizygous FLNA variant in West syndrome without periventricular nodular heterotopia (2020)
  • Author(s): Hiromoto Y., Azuma Y., Suzuki Y., Hoshina M., Uchiyama Y., Mitsuhashi S., Miyatake S., Mizuguchi T., Takata A., Miyake N., Kato M. and Matsumoto N.
  • Journal Title: Hum Genome Var Volume: 7 Pages: 43
  • DOI: 10.1038/s41439-020-00131-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical and genetic characteristics of patients with Doose syndrome (2020)
  • Author(s): Hinokuma N, Nakashima M, Asai H, others, Mizuguchi T, Iwama K, Itai T, Miyatake S, Saitsu H, Matsumoto N and Kato M
  • Journal Title: Epilepsia Open Volume: 5 Pages: 442-450
  • DOI: 10.1002/epi4.12417
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] De Novo Truncating Variants in the Last Exon of SEMA6B Cause Progressive Myoclonic Epilepsy (2020)
  • Author(s): Hamanaka K, Imagawa E, Koshimizu E, Miyatake S, Tohyama J, Yamagata T, Miyauchi A, Ekhilevitch N, Nakamura F, Kawashima T, Goshima Y, Mohamed A R, Ch'ng G S, Fujita A, Azuma Y, Yasuda K, Imamura S, Nakashima M, Saitsu H, Mitsuhashi S, Mizuguchi T, Takata A, Miyake N and Matsumoto N
  • Journal Title: Am J Hum Genet Volume: 106 Pages: 549-558
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2020.02.011
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Reply to "GGC Repeat Expansion of NOTCH2NLC is Rare in European Leukoencephalopathy" (2020)
  • Author(s): Doi H, Okubo M, Fukai R, Fujita A, Mitsuhashi S, Takahashi K, Kunii M, Tada M, Fukuda H, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Sone J, Sobue G, Takeuchi H, Matsumoto N and Tanaka F
  • Journal Title: Ann Neurol Volume: 88 Pages: 642-643
  • DOI: 10.1002/ana.25819
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nonsense variants of STAG2 result in distinct congenital anomalies (2020)
  • Author(s): Aoi H, Lei M, Mizuguchi T, Nishioka N, Goto T, Miyama S, Suzuki T, Iwama K, Uchiyama Y, Mitsuhashi S, Itakura A, Takeda S and Matsumoto N
  • Journal Title: Hum Genome Var Volume: 7 Pages: 26
  • DOI: 10.1038/s41439-020-00114-w
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ターゲットロングリードシーケンスを用いたリピート伸長変異解析 (2020)
  • Author(s): 水口剛
  • Organizer: 日本人類遺伝学会第65回大会
  • Invited
• [Remarks] 新技術ロングリード・シークエンサーで てんかんの原因となる繰り返し塩基配列の正確な配列を決定
  • URL: https://www.yokohama-cu.ac.jp/amedrc/news/20210401matsumoto_brain.html