2020 Fiscal Year Research-status Report

Integrated analysis of pathgenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia

Research Project

Project/Area Number	20K08272
Research Institution	National Cardiovascular Center Research Institute
Principal Investigator	岩朝徹国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 病院, 医師 (80712843)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	渡邉裕介国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (20562333) 中川修国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (40283593) 浦崎明宏国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40550083) 黒嵜健一国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 病院, 特任部長 (40561460) 石川泰輔国立研究開発法人国立循環器病研究センター, オープンイノベーションセンター, 室長 (60708692) 白石公国立研究開発法人国立循環器病研究センター, オープンイノベーションセンター, 部長 (80295659)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	ACVRL1 / 遺伝性出血性末梢血管拡張症 / BMPシグナル / SMAD
Outline of Annual Research Achievements	過去に当センターで遺伝性出血性末梢血管拡張症の患者より検出した遺伝子変異と論文報告のあった同疾患患者の遺伝子変異について、変異プラスミドの作成と実験解析に向いたミスセンス変異のACVRL1変異及び野生型ACVRL1について、過去の論文を参考にマウス線維芽細胞株（本来ACVRL1の発現を持たないNIH-3T3細胞)にプラスミドを用いて導入した。野生型を導入した細胞ではACVRL1をBMP9/10により刺激することで、その下流に位置する活性型(リン酸化)SMAD1/5といった蛋白の出現（ウエスタンブロットで解析）や、下流に位置する転写因子の一群の発現の亢進（ルシフェラーゼアッセイで解析）が見られることを確認した。一方で、変異型を導入した細胞の多くは下流の活性型(リン酸化)SMAD1/5、転写因子の発現が抑制されていたが、一部の変異では抑制されておらず、実際の症状を生じている患者との間にdiscrepancyが認められた。また変異型を導入した細胞での免疫染色では、多くの変異では野生型ACVRL1と大きな変化は確認出来なかったが、一部の変異（膜通過部分の変異）においては細胞表面に存在するはずのACVRL1が消失していることが確認出来た。これらの細胞実験において生じる現象の差違が、実際の患者さんの症状の重篤さや発症様式に関連するか、今後検討を加えていく予定である。また合わせてゼブラフィッシュに変異型ACVRL1を導入し、実際の生体内で血管形成が変化していくかどうかを順次確認を加えていく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 患者検体から検出したACVRL1の変異作成とマウス線維芽細胞への導入に際し、導入プラスミドにより出現する蛋白の変化、転写因子の変化を評価する系を作成するために、基礎検討のみで約7ヶ月を要した。この上で患者から検出した変異（合わせて論文報告のある変異）について、解析を開始しており、概ね順調に推移していると考えている。但し本疾患の責任遺伝子のもう一つであるendoglinに関しては変異導入系が確立できておらず、若干後にずれ込む見込みである。
Strategy for Future Research Activity	これまで解析した分については早期に論文としてまとめて報告を行うが、続いて過去の論文報告のあるACVRL1ミスセンス変異なども解析対象として例数を増やして解析する。もう一つの責任遺伝子であるendoglinの変異解析は、変異導入系が確立できれば解析は上記ACVRL1変異のものの多くを流用できるため、endoglin変異の導入系についても基礎検討を開始する。
Causes of Carryover	コロナウイルスの流行により、学会出張の旅費分を使用しなかったため、未使用金が生じた。また患者検体からの遺伝子変異検出よりも細胞実験の基礎検討を重視して実施した結果、基礎検討部分での使用が予定よりも少なくなった。次年度以降基礎研究部分を広げて実験を重ねることで、昨年の使用しなかった分も含め使用していく予定。