口腔・腸内細菌と濾胞性ヘルパーT細胞を標的とした自己免疫性肝炎の病態解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08290
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 阿部 和道 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (30468128)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 敦史 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (40404868) ; 林 学 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (80745787) ; 大平 弘正 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (90274951)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 自己免疫性肝炎 / 腸内細菌叢 / Veillonella dispar / Tfh細胞

Outline of Annual Research Achievements

AIHマウスモデル作成：メスC57BL/6マウスの肝臓から精製したS-100抗原タンパク（0.5-2mg/mLを0.5mL）とcomplete Freund’s adjuvant(CFA、0.5mL)をメスC57BL/6マウスにday0、day7に腹腔内投与し、4週間後に慢性肝炎を発症しAIHマウスモデルを作成。いずれのAIHモデルも頬静脈採血、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、頸椎脱臼で安楽死させたのちに、肝臓を採取する。 血漿のALT、IgG、抗核抗体、また肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色で評価しAIHモデルとなっているか確認する。ALTの上昇や肝組織の炎症が弱いので繰り返しモデル作成を試みる。
AIHマウスモデルに抗菌薬[オートクレーブ水1Lで1g/Lアンピシリン1g/L、ネオマイシン1g/L、バンコマイシン0.5g/L、メトロニダゾール1g/L、甘味料（Sweetener Sweet’n Low、サッカリン）60g/Lを溶解し、100mL/ボトルを週2回置き換える]の飲料水経由で7日間腸管除菌する。PBSで希釈した口腔細菌1x108CFU/200μl（Veillonella dispar：株式会社KACから購入）を経口ゾンデを用いて経口投与し、4週間後に、頬静脈採血し、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、その後頸椎脱臼で安楽死させ、肝臓、腸管、便を採取する。その後次世代シーケンサ・アンプリコン解析を用いてマウス便の腸内細菌叢の変化、肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色を用いて肝炎発症や重症化、軽減の有無を確認する。
今後、AIHマウスモデルにFITC-dextranを用いて腸管透過性を評価する.AIHマウスモデルから腸管, 肝臓を摘出し, フローサイトメトリーや免疫染色でTfh細胞の数や浸潤程度, 機能を解析する.

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

AIHマウスモデルが予定する肝炎所見を呈していない。Veillonella disparの培養管理も検討する。

Strategy for Future Research Activity

AIHマウスモデルがうまく作成できれば、Veillonella disparの培養管理し投与していく。うまく作成できない場合は、LPSの腹腔内投与を行い炎症が惹起された環境でAIHマウスモデルの肝炎変化を確認する。
さらに、AIHマウスモデルにFITC-dextranを用いて腸管透過性を評価する.AIHマウスモデルから腸管, 肝臓を摘出し, フローサイトメトリーや免疫染色でTfh細胞の数や浸潤程度, 機能を解析する.

Causes of Carryover

コロナの影響もあり実臨床に追われて実験時間の確保ができなかった。また、AIH肝炎モデルの作成に時間がかかっており、その後の実験計画が遅れ、次年度使用額が生じた。今年度に計画した研究を遂行する。