2020 Fiscal Year Research-status Report
グルカゴン分泌機構解明のためのヒトiPS細胞由来膵α細胞の分化誘導系の構築
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20K08321
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| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
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Principal Investigator |
矢部 茂治 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 研究員(移行) (40533716)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | グルカゴン / 膵α細胞 / ヒトiPS細胞 / アルギン酸fiber / 糖尿病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究においてヒトiPS細胞から機能的膵α細胞を選択的かつ効率的に分化誘導する系を構築する事で、現在遅れているグルカゴン分泌機構等のヒト膵α細胞研究を推進する。糖尿病における高血糖状態にはインスリン不足のみでなくグルカゴン過剰分泌も主要因になっている事が示唆されており、ヒトα細胞のグルカゴン分泌機構の解明が非常に重要であるが、現在研究に使用できるヒト膵α細胞を入手する事は困難であるため、ヒトα細胞研究は遅れている。現在ヒトES/iPS細胞由来膵β細胞分化誘導については世界中で研究が進められて、多くの論文が発表され続けているが、ヒトES/iPS細胞由来膵α細胞分化誘導については現在まで2本論文が発表されているが、申請者が調べた限りではそれ以外の報告が無く未開拓の領域となっている。申請者は膵β細胞分化誘導系構築のために、様々に分化誘導系の条件検討をした際にドミナントに膵α細胞分化へと向かわせる条件を見出した。この分化コントロール法は現在まで報告が無く申請者独自の方法となっている。また分化誘導したα細胞をより機能的に成熟化する事および分泌異常系を構築するには長期培養系が重要となるが、分化誘導した細胞をアルギン酸で出来たfiberに封入することでマウス移植による生体内および生体外の培養において半年-1年間維持できる事を可能にした。
本研究においてヒトiPS細胞由来膵α細胞分化誘導系の最適化、グルカゴンプロモーターにより蛍光タンパク質が発現するiPS細胞株の樹立による膵α細胞の可視化による選別、分化誘導した膵α細胞の長期維持を可能とするアルギン酸によるファイバー化技術を用いたグルカゴン過剰分泌系の再現を行い、現在遅れているグルカゴン分泌機構等のヒト膵α細胞研究を推進する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一年目は計画通りにヒトiPS由来膵α細胞の分化誘導系の構築に取り組んだ。申請者が見出した膵α細胞分化誘導系の分化効率・安定性を上げるため、さらなる分化誘導系の検討を行った。分化誘導系はヒトiPS細胞→胚性内胚葉→原始腸管→後方前腸→膵前駆体→膵内分泌前駆体→ホルモン産生細胞という6ステップからなり成長因子・小分子化合物等様々な因子を添加して培養を進めるが、どの段階でどのような化合物(X,Yの2種類)を加えれば膵α細胞に向かうようになるかは同定済みであるので、化合物の組み合わせ(単独か混ぜるか)・化合物の濃度・処理時間(各ステップはおのおの数日かかる)等をさらに検討してより効率的にα細胞分化に向かう条件を決めた。効果は分化した膵α細胞特異的マーカーであるグルカゴンやARX等のqPCRによる遺伝子発現量解析、免疫染色による陽性細胞率の測定、および低グルコースや高グルコールで刺激によるグルカゴン分泌実験を行い、ELISAによりグルカゴン分泌量を調べる事で総合的に判定した。その結果、効率的なヒトiPS細胞由来膵α細胞の分化誘導系が構築出来て、論文をpublishする事も出来た。また、グルカゴンプロモーターにより蛍光タンパク質が誘導されるヒトiPS細胞の樹立のためのconstruct作成も進行している。これらの結果から、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1年目は効率的ヒトiPS細胞由来膵α細胞の分化誘導系を構築した。2年目以降は分化誘導したヒトiPS細胞由来膵α細胞をより成熟化させる検討を行う。またヒトiPS細胞よりゲノムDNAを抽出し、PCRによりグルカゴンプロモータ領域を増幅し、グルカゴンプロモーターにより蛍光タンパク質の発現がdriveされるlenti virus vectorのconstructを構築して、グルカゴンプロモーターにより蛍光タンパク質の発現がdriveされるヒトiPS細胞の樹立を行う。この樹立したiPS細胞を膵α細胞に分化誘導し、アルギン酸でfiber化して、生体外、および生体内で長期維持を行う。生体内の系ではSTZにより糖尿病にしたNOD/SCIDマウスに移植を行い、糖尿病状態にさらす事でグルカゴン分泌異常の再現を狙う。解析はマウスの血中グルカゴン量で判定するが、このfiberはマウス体内から取り出す事が可能であるので、取り出したfiberのグルカゴン分泌実験・免疫染色・qPCRなどによる解析も行う。生体外の系ではdish/wellにおいて培養液で培養し、高グルコース、脂質などの糖尿病からくるストレス因子で負荷を掛けてグルカゴン分泌異常状態を再現する。コントロールとしては生体内においては正常なマウスへの移植、生体外ではグルコール、脂質等の負荷を掛けない培地で維持してグルカゴン分泌実験・免疫染色・qPCRなどで比較解析を行う。また解析の結果、効果的に分泌異常を再現出来たサンプルとコントロール間においてRNA-sequence等で網羅的遺伝子発現解析を行う。
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