2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of a high-precision diagnostic method for heart failure utilizing abnormal biosynthesis of beta-atrial natriuretic peptide in the failing heart
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20K08414
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| Research Institution | Protein Research Foundation |
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Principal Investigator |
南野 直人 (財)蛋白質研究奨励会, その他部局等, 研究員(移行) (50124839)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
海谷 啓之 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40300975)
白井 学 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, オープンイノベーションセンター, 室長 (70294121)
若林 真樹 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, オープンイノベーションセンター, 室長 (70552024)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 心房性ナトリウム利尿ペプチド / 心不全 / 診断法 / β-ANP / 生合成機序 / 内在分子型 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）は、前駆体proANP、活性型α-ANPとα-ANPの二量体β-ANPの3分子型で生体内に存在する。心不全発症により出現するβ-ANPの生合成機序とproANPの分泌亢進機序の解明、及び心不全におけるこれらの分子型の血中濃度測定の意義を明らかにするため、令和2年度は、①3種のANP分子型測定法の高精度化を進め、特にβ-ANPの測定法の再現性改善に努めた。②ヒト臨床試料、臨床情報の収集を完了し、組織試料の分割・秤量、抽出を行った。③各分子型の測定に適するの組織使用量を設定し、ANP3分子型に加えてBNP2分子型の測定を進めた。
令和2年度の重要な成果は、心房でのみ産生されると推定されていたβ-ANPが心室でも有意な濃度で確認された症例、及びβ-ANPを高濃度に産生する心房組織があり、その存在様式（前駆体型分子の有無）の検討が各部位で可能と判明したことである。また、組織レベルでANPもダイナミックな量的変動と分子型比率の変動を示すことが分かり、RNA-seq解析によりその変動原因や生成酵素などを見出せる可能性が高いと推定された。これらの測定結果と臨床情報の比較解析に基づき、心筋組織におけるβ-ANPをはじめとするANP3分子型の濃度や比率と、これらの血中濃度変動との関連が推定されれば、心不全病態の診断への利活用も十分可能と考えられた。
次年度実施予定のRNA-seq解析について、RNA調製法や精製の必要性、収集条件の異なる組織（剖検、手術）でのデータの質などを検討し、解析対象を選出後、速やかにRNA-seq解析の実施を可能とした。心筋細胞培養やタンパク質解析についても、これまでの実績に基づく作業確認、実験準備を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和2年度は、4月から6月に掛けて新型コロナ感染対策のため、勤務のリモート化などが実施され、非常勤職員を中心に実験可能な勤務時間が大きく減少した。この結果、ヒト心筋組織試料の収集完了後、バイオバンクを経由して必要量の心筋組織の払出、臨床情報の収集や提供に時間を要した。これらが本年度における研究進展を阻害した大きな要因である。
凍結心筋組織よりドライアイス上で脂肪組織を除去して必要量の組織を分割、入手する作業にも時間を要したが、その後の抽出作業などは順調に進められた。3種のANP分子型の測定法の改良については、標準とする前駆体リコンビナントペプチドの精製、RIAなどの他の定量法を用いた量的確認、血液試料の測定における干渉因子の排除などの検討を行い、再現性の向上に努めた。まだ全試料の組織濃度の確定には至っていないが、これらの基盤作業により、各症例で想定以上の濃度や比率の変化が認められることが明らかとなった。特に部位毎のβ-ANP免疫活性物質の分子特性を解析することにより、生成機序、変動比率などを推定できる可能性が高いと推察された。
加えて、次年度に実施予定のRNA-seq解析、心筋細胞培養系、タンパク質解析などの準備もできているため、これらを総合して上記の進捗区分と判断した
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度の研究より、心室心筋組織においてもβ-ANP産生が示唆されたので、心室心筋及び心房心筋組織のゲルロ過及び逆相HPLCなどにより、β-ANP関連分子の濃度と比率を明らかにし、RNA-seq解析データとそれに基づくGO解析、pathway解析、GSEA解析の結果を総合して、β-ANPの生合成に関わる酵素群やシャペロン（切断、SS再構成など）の推定を進める。特にβ-ANP前駆体の存在が確認されれば、切断、SS結合形成機序や生成部位の同定が大きく進むと考えている。また、生合成酵素群やシャペロンタンパク質が推定できれば、これらを起点に生合成タンパク質複合体の同定も可能と考えられる。
培養細胞実験系では、心室心筋でのβ-ANP産生が確認できれば、心房及び心室心筋細胞を用いて各種ストレス実験系で産生変動を評価し、心筋細胞内でのβ-ANPやα-ANPの産生増加の原因を推定する。
臨床検体の測定については、心不全症例血液でβ-ANPを含むANP3分子型で実施し、BNP濃度と臨床情報、組織や細胞レベルでの実験結果も踏まえて、血液濃度測定の臨床的意義を明らかにする計画である。
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| Causes of Carryover |
ラット心筋細胞培養関係並びにANPの3分子型の測定系改善に関しては、過去の研究での残余試薬や器具などがあり、令和2年度の研究実施範囲内では、新規の試薬や器具購入の必要性が限定的であったため、次年度使用経費が発生した。
令和2年度の研究で心室組織でのβ-ANP産生の可能性が高まり、心房と心室由来の心筋細胞を用いて多様なβ-ANP産生制御実験を実施できる見込みとなった。このため、次年度は当初計画以上に心筋細胞培養実験を行う予定で、これに合わせてANP3分子型の測定実験も増加する見込である。このため繰越予算は、培養心筋細胞実験とANP3分子型測定に充当する予定である。
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