2020 Fiscal Year Research-status Report

Studies on resistance mechanisms of multidrug-resistant Enterobacteriaceae bacteria and the effects of biofilm formation on resistance

Research Project

Project/Area Number	20K08849
Research Institution	St. Marianna University School of Medicine
Principal Investigator	竹村弘聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (80301597)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	大神田敬聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (40793469) 國島広之聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (60339843)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	β-ラクタマーゼ / カルバペネム耐性腸内細菌目細菌 / Enterobacter cloacae
Outline of Annual Research Achievements	わが国で検出されるCREの多くはカルバペネマーゼ産生菌（CPE）ではない所謂non CPE-CREである。Klebsiella aerogenes、Enterobacter cloacaeなどの腸内細菌科細菌は、染色体上に非伝達性のAmpC型β-ラクタマーゼ（以後AmpC）の遺伝子を持っていて、β-ラクタム薬の誘導によりβ-ラクタマーゼ（BL）を産生する。またAmpC過剰産生株にはプラスミド性AmpC遺伝子を保有している株とそうでない株が存在する。申請者は本研究において、様々なnon CPE-CREを含むCREの耐性及び薬剤耐性伝達のメカニズム、その疫学的特徴を明らかにしたいと考えている。そこで、手始めに令和2年度は、E. cloacae の臨床分離菌でβ-ラクタム薬感性株、IMP-1型のCPE、AmpC過剰産生株、標準菌株（ATCC13047）などを用いて、BLの産生性を簡便に評価できる実験系の構築と抗菌薬がBL産生性に及ぼす影響を試みた。カルバペネマーゼ産生性の評価法であるmCIM法の実験系でIMP-1型CPE（SMUM-6587）の菌体及び培養上清を経時的に回収し、カルバペネム薬であるイミペネム（IPM）と反応させた後にペーパーディスクに染みこませ、Micrococcus luteusを用いたbioassayを利用してIPMの失活を検討した。この結果IMP-1などのBLの細菌培養上清中への分泌を検討したが、検出できなかった。BLは従来から細菌の細胞壁内のペリプラズム領域に局在すると言われており、細菌を超音波破砕した破砕液（BL粗酵素液）を用いて同様の手順で検討したところ、IPMの失活を確認できた。mCIM法においてIMP-1は、メロペネム（MEPM）diskの存在によって誘導されて分泌されるわけではなく、増菌培養開始前から元々菌体内に存在していることが判った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 上記の成果に加えて、さらにE. cloacaeが産生したBLの量を簡便に計測する方法の開発を試みている。すなわち大腸菌の標準菌を5×10の5乗/mL、大腸菌のMICの4倍濃度（4×MIC）の抗菌薬（β-ラクタム薬）を加えたMHBを0.1mL/wellで96穴のマイクロプレートにシードし、そこに総タンパク量を一定に調整したBL粗酵素液を1/2希釈系列で0.1mL/well添加して、18時間、35℃で培養する。これはMIC測定法である微量液体法を応用した検査法で、プレートの左側から順にBL量が1/2希釈されるので、加えたBLの量が多いほど菌の発育があるwellが多くなる。すなわち菌の発育が観られた最小のBL粗酵素液の総タンパク量が小さいほど、BL粗酵素液中の総タンパク当たりのBLが多いことになり、抗菌薬を変えることでBLの基質特異性も同時に評価できる。本法は従来から用いられるニトロセフィン法によるUV検出でのBL定量法と良く相関することも確認した。本研究は、様々なCREのBL産生による耐性、薬剤耐性伝達機序の解明、より有効な抗菌薬療法の確立を主な目的としている。様々なCREを含むE. cloacaeのBL産生性の評価法の確立という点では、一定の成果を得ることができた。また本研究と関連した研究の成果として、川崎市内の臨床分離菌のカルバペネム薬を含む抗菌薬に対する薬剤感受性のサーベイランスに関して、研究成果をまとめることができた。このため達成度としては、(2) のカテゴリーとした。
Strategy for Future Research Activity	昨年までの研究で得た知見や開発した方法を利用して、様々なnon CPE-CREを含むCREを用いて、①BL産生性に影響する因子の検討、②各種BL阻害剤の評価、③他系統抗菌薬がBL産生性に及ぼす影響、④バイオフィルム産生がBL産生性に及ぼす影響などを順次評価していき、顕著な成果が出そうなものを優先的に実験的に解明していくつもりである。これらの研究成果をまとめて、国内外の学会、学術雑等で報告すること当面の目標とする。さらに本研究の大きなテーマであるCRE、ESBLsなどの多剤耐性グラム陰性桿菌がバイオフィルムを形成することで、菌の耐性化、感染難治化に、どのような影響を及ぼすのかについての検討にも取り組んでいく予定である。
Causes of Carryover	昨年までの研究で得た知見や開発した方法を利用して、様々なnon CPE-CREを含むCREを用いて、①BL産生性に影響する因子の検討、②各種BL阻害剤の評価、③他系統抗菌薬がBL産生性に及ぼす影響、④バイオフィルム産生がBL産生性に及ぼす影響などを順次評価していき、顕著な成果が出そうなものを優先的に実験的に解明していくつもりである。これらの研究成果をまとめて、国内外の学会、学術雑等で報告すること当面の目標とする。さらに本研究の大きなテーマであるCRE、基質拡張型BL産生菌（ESBLs）などの多剤耐性グラム陰性桿菌がバイオフィルムを形成することで、菌の耐性化、感染難治化に、どのような影響を及ぼすのかについての検討にも取り組んでいく予定である。様々なCREの臨床分離菌を収集し分子生物学的手法で耐性遺伝子を解析すること、各種抗菌薬の薬剤感受性を評価すること、さらに耐性遺伝子の接合伝達、バイオフィルム形成の実験系の構築などを予定しており、各種PCRプライマー、標準菌株、抗菌薬、実験試薬、消耗資材の購入に出費が予想される。また研究成果を、国際的な学会及び誌上で発表したいと考えており、その準備や遂行に費用が必要と考えている。