2021 Fiscal Year Research-status Report
Studies on resistance mechanisms of multidrug-resistant Enterobacteriaceae bacteria and the effects of biofilm formation on resistance
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20K08849
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
竹村 弘 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (80301597)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大神田 敬 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (40793469)
國島 広之 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (60339843)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | β-ラクタマーゼ / バイオフィルム / カルバペネム耐性腸内細菌目 / カルバペネマーゼ産生菌 / 接合伝達 / 抗菌薬 / 薬剤感受性 / ESBL |
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| Outline of Annual Research Achievements |
わが国で検出されるCREの多くはカルバペネマーゼ産生菌（CPE）ではない所謂non CPE-CREである。またCPEとしてはIMP-1産生Enterobacter cloacaeが多く、その傾向は東日本で顕著である。研究代表者は本研究において、様々な角度からCPE、non CPE-CREの耐性及び薬剤耐性伝達のメカニズム、その疫学的特徴を明らかにしたいと考えている。令和3年度に引き続き、E. cloacae の臨床分離菌などを用いて、βラクタマーゼ（BL）の産生性を簡便に評価できる実験系の構築と抗菌薬がBL産生性に及ぼす影響について検討した。また現代医療において体内留置デバイスは不可欠なものだが、その周囲に細菌が付着すると、増殖する過程でバイオフィルムという構造を形成し、これが感染症の難治化の原因となる。このバイオフィルムの中では、生残のために菌同士が協調的に働くことが知られており、抗菌薬に対する抵抗性、BL産生性、耐性遺伝子の伝達効率などに影響を及ぼすことが容易に想像される。この観点からIMP-1産生E. cloacaeなどプラスミド伝達性耐性遺伝子保有株をドナー、バイオフィルムを形成した状態の大腸菌をレシピエントとして接合伝達効率を検討する実験系の確立をめざした。これより先に、バイオフィルム形成性を定量的に評価するための実験系を既存の方法を改変して自作し、大腸菌の各種臨床分離菌やコンピーテント細胞のバイオフィルム形成性をスクリーニング検査した。また大腸菌のリファンピシン耐性変異株をレシピエントとして、既存の方法を改変することでドナーであるBL産生菌から各種耐性遺伝子の接合伝達性を評価できる実験系を確立した。さらに大腸菌のバイオフィルム過剰産生株を用いて、微量液体希釈法で最小発育阻止濃度を測る要領で、バイオフィルム産生性を明らかに抑制する濃度を検討できる実験系を開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和3年度に引き続き、カルバペネマーゼ産生性の評価法としてマイクロプレートを用いたBL産生性を半定量的に評価する方法の開発し、従来からあるニトロセフィン法による定量の結果と矛盾しないことを確認した。大腸菌の標準菌株を5×10の5乗/mL、大腸菌のMICの4倍濃度（4×MIC）の抗菌薬（βラクタム薬）を加えたMHBを0.1 mL/wellで96穴のマイクロプレートに接種し、そこに総タンパク量を一定に調整したBL粗酵素液を1/2希釈系列で添加し、18時間、35℃で培養、BLが4×MIC抗菌薬を加水分解して標準菌株が発育する最小濃度を求める。この方法を用いて、セフメタゾールなどのβラクタム薬でE. cloacae のAmpC産生が誘導されること、クリンダマイシンがAmpCのBL誘導を4-64μg/mLで濃度依存的に抑制することなどを明らかにした。またカルバペネマーゼであるIMP-1に関してはβラクタム薬で誘導されなかった。さらに大腸菌のバイオフィルム形成性を定量的にスクリーニング検査し、RFP耐性のコンピテント細胞である大腸菌ML4909株がバイオフィルム過剰産生株であることを見いだした。またこのML4909株をレシピエントして、IMP-1産生E. cloacae、ESBL産生大腸菌をドナーとして接合伝達実験にも成功しており、現在様々な条件でバイオフィルム形成菌における接合伝達率を検討している。本研究は、様々なCREのBL産生による耐性、薬剤耐性伝達機序の解明、より有効な抗菌薬療法の確立を主な目的としている。CREを含むE. cloacae、大腸菌のBL産生性、大腸菌のバイオフィルム形成量、バイオフィルム形成大腸菌における接合伝達率など様々な評価系の確立という点では、一定の成果を得ることができた。このため達成度としては、(2) のカテゴリーとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年ML4909株がバイオフィルム過剰産生株であることを見いだしたことによって、微量液体希釈法で最小発育阻止濃度を測る要領で、バイオフィルム産生性を明らかに抑制する濃度を検討できる実験系にめどがついた。これらの研究で得た知見や開発した方法を利用して、様々なnon CPE-CREを含むCREを用いて、①BL産生性に影響する因子の検討、②各種BL阻害剤の評価、③他系統抗菌薬がBL産生性に及ぼす影響、④バイオフィルム産生が接合伝達性に及ぼす影響、⑤抗菌薬の抗バイオフィルム効果などを順次評価していき、顕著な成果が出そうなものを優先的に実験的に解明していくつもりである。これらの研究成果をまとめて、国内外の学会、学術雑等で報告すること当面の目標とする。さらに本研究の大きなテーマであるCRE、基質拡張型BL産生菌（ESBLs）などの多剤耐性グラム陰性桿菌がバイオフィルムを形成することで、菌の耐性化、感染難治化に、どのような影響を及ぼすのかについての分子生物学的検討にも取り組んでいく予定である。
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| Causes of Carryover |
昨年までの研究で、E. cloacaeのIMP-1、AmpCなどのBLの挙動、バイオフィルム形成能、バイオフィルム形成菌における接合伝達率、抗菌薬の抗バイオフィルム効果などを検討できる実験系を作成することができた。当初、抗菌薬、高価な基質、実験用菌株の新規購入、外注検査を含めて研究費用がかさむと考えられていたが、考えていたよりも順調にこれらの実験系を確立でき、また既存の方法も含めて全体的に比較的安価で実験が行えたため、今年度の研究費が予定よりも少なくて済んでいる。また今年度は、新型コロナ感染症の蔓延の影響で通常の研究に割けるエフォートが少なくなったこと、研究成果を国内外の学会等で発表する機会を失ったことも研究費の使用減少した理由である。
様々なCREの臨床分離菌を収集し分子生物学的手法で耐性遺伝子を解析すること、各種抗菌薬の薬剤感受性を評価すること、さらに耐性遺伝子の接合伝達、バイオフィルム形成の実験系の構築などを予定しており、各種PCRプライマー、標準菌株、抗菌薬、実験試薬、消耗資材の購入に出費が予想される。また研究成果を、国際的な学会及び誌上で発表したいと考えており、その準備や遂行に費用が必要と考えている。
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Research Products
(1 results)
