Development of high efficacy human iPS generating using mRNA

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09155
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 千本松 孝明 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70216563)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中嶋 博之 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (40393235) ; 吉武 明弘 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70327550) ; 井口 篤志 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (90222851)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: iPS / mRNA / インターフェロン

Outline of Annual Research Achievements

外科手術等の治療の過程で、残余検体として得られた患者組織から分別培養により得られた初代培養細胞は老化や病態を有した正常とは異なる細胞であり、ヒトiPS誘導効率は極端に低下する。このような患者こそ増殖性を有する自家細胞から再生可能なヒトiPS細胞技術は重要と考え、高効率なiPS誘導法の研究を行ってきた。その中で、episomal vector + Lonza Japan社のNucleofector 2b + VPI-1002（導入溶液）+ U-20 (Nucleofector 2b付帯の導入方法)の組み合わせを用いることでより高効率なヒトiPS細胞誘導法を確立した（Tanaka N、et al. Development of a High-Efficacy Reprogramming Method for Generating Human Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells from Pathologic and Senescent Somatic Cells. Int J Mol Sci. 2020 Sep 15;21(18):6764.)。 しかし、電気穿通法では十分量のDNA量と高負荷電気穿通法が必要であることはこれまでの実験で判明しており、宿主細胞のゲノムDNA損傷やゲノム変異といった細胞ダメージは無視出来ない。そこでこのプロジェクトでは、宿主細胞へのダメージが最も少ないと考えられる山中因子mRNAを用いた高効率なヒトiPS細胞の誘導法を確立し、老化もしくは病態を有した細胞からも十分高品質なヒトiPS細胞誘導を可能とし、誘導されたヒトiPS細胞の品質を評価していく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

より宿主細胞のDNAダメージを避け、かつ極めて高効率なnon-integration methodとして山中4因子RNAをリポフェクションを用いて山中因子導入を試みている。Self-replicative RNA vectorからvectorを制限酵素で切断したのち精製し、RNA Cappingは回収率も悪くならない程度にコンスタントな精製は可能となった。更にT7-VEE vectorにhuman FOXO3 gene を組み込んだvectorを作製し、遺伝子導入可能となった。線維芽細胞への精製された山中RNAの導入では、導入後2-日目に細胞はほぼ死滅することも確認され、これにより細胞内へRNAが導入され、かつインターファロン放出によるアポプトーティックな細胞死であることが確認された。
インターファロン放出によるアポプトーティックな細胞死抑制方法として、インターフェロン抑制剤の１つであるrecombinantB18-Rと線維芽細胞にB18R mRNAを遺伝子導入し、分泌されるB18R（B18R conditioned medium)環境を構築し、この環境下での山中因子RNA導入の目処が就きつつある。

Strategy for Future Research Activity

リポフェクタミンによる山中因子RNA群の細胞導入環境、すなわちインターファロン放出による細胞死を十分に抑制出来る導入環境（recombinantB18-RとB18R conditioned medium）は整いつつあり、preliminaryであるが、RNA導入されても宿主細胞は死に至らない。
本年度は、この環境下で作製したT7-VEE human FOXO3 vector等山中因子以外の誘導に重要な因子の組み合わせを試みることにより、より最適なRNA導入環境を構築すると同時にこれまで研究室で培われたepisomal vector + 電気穿孔法との差異も確認予定である。

Causes of Carryover

初年度の目標として、Self-replicative RNA vectorからのRNA精製の回収効率の確認が1つの大きな実験項目になると考えていた。そのため、その精製過程で使用するRNA Cappingは高価であり、比較的高い予算を組んでいたが、1-2回の精製実験で比較的安定的にそして相応の回収率が確認できたので、予想を下回るランニングコストとなったのが1つ理由である。
また、インターフェロン抑制剤の１つであるrecombinantB18-Rの使用以外にB18R conditioned mediumの作製に成功し、初年度としてコスト削減につながった。
次年度使用分は、新たなSelf-replicative RNA vector（T7-VEE human Tet-1の作製）、また誘導されたiPS細胞の心筋誘導の際に用いたい新しいペプチドの購入に当てて行きたいと考えている。