Development of high efficacy human iPS generating using mRNA

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09155
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 千本松 孝明 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70216563)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中嶋 博之 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (40393235) ; 吉武 明弘 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70327550) ; 井口 篤志 埼玉医科大学, 医学部, 客員教授 (90222851)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ヒトiPS細胞 / 患者残余検体 / mRNA / インターフェロン

Outline of Annual Research Achievements

iPS細胞誘導時にゲノム点突然変異や遺伝子コピー変異等が確率的に混入し、iPS細胞としての品質は安定せず、臨床応用とりわけ安全面との間に大きな溝が残されている。加えて患者組織、すなわち診療治療過程で剥離された病的組織（残余検体）から得られた初代培養細胞を用いた場合のヒトiPS誘導効率は極端に低下する。このプロジェクトでは、宿主細胞へのダメージが最も少ないと考えられる山中因子mRNAを用いて高効率なヒトiPS細胞の誘導法を確立し、誘導されたヒトiPS細胞の品質を評価していく。

初年度及び2年度は、Self-replicative RNA vectorからのRNAの精製の純度及び高効率回収の方法の確立、そして巨大mRNA導入による宿主細胞インターフェロン放出による細胞死抑制のための実験系確立に注力した。

現在上記２つの主たる問題点はクリアできており、確立された実験系で患者組織という病的な体細胞からでも高効率かつ高品質なヒトiPS細胞誘導法を目指していく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請書に記載した巨大なmRNA導入により誘導されるインターフェロン放出に関して、recombinantB18-R及びB18R mRNAを組み込まれたベクター（B18R mRNA--E3L）による遺伝子導入を用いて、高濃度B18-R環境を構築し、mRNA導入しても細胞死に至らない環境の構築は可能となった。またSelf-replicative RNA vectorからのRNA精製の純度は極めて重要で、得られたmRNAの濃度や純度が少しでも悪いと遺伝子導入レベルも極端に落ちる。主としてこの2点の問題点はクリア出来ており、現在では安定したiPS誘導系が確立出来ている。現在これに脱メチル化遺伝子であるTet-1をSelf-replicative RNA vectorに組み込み実験を遂行している。

Strategy for Future Research Activity

Self-replicative RNA vectorを用いた山中因子mRNAによるヒトiPS細胞誘導系はほぼ確立された。この方法で誘導されたiPSとこれまで通り当該研究室で構築された山中因子episomal vector群の電気穿通法により誘導されたiPS細胞の比較検討を行う。最重要は、宿主細胞のよりダメージの少なく、加えて病的因子や老化遺伝子が多く含まれる診療加療過程で剥離された病的組織からも十分かつ高品質なヒトiPS細胞誘導法の確立である。

Causes of Carryover

研究概要及び現在の進捗状況にも記載したが、mRNA精製とインターフェロン放出に細胞死抑制実験に注力したため、実験費消費に至らなかった。ただbreakthrough出来たため、予定は実験遂行予定である。