2020 Fiscal Year Research-status Report
極低温電子顕微鏡を用いた単粒子解析による局所麻酔薬の結合阻害機構の解明
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20K09193
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
入江 克雅 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 助教 (20415087)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 局所麻酔薬 / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
この研究は、局所麻酔剤認識メカニズムの構造基盤を解明し、より効率良く・より副作用の少ない局所麻酔薬の開発を可能にすることである。局所麻酔薬の標的は膜電位感受性ナトリウムチャネルである。そこでまず、本研究課題では、ナトリウムチャネルと所属研究室の先行研究で明らかにした安定な結合が可能な局所麻酔薬との複合体を極低温電子顕微鏡による単粒子解析を用いて原子分解能での構造決定を目指している。
目的達成のために、ナトリウムチャネルと局所麻酔薬複合体のクライオ電子顕微鏡による観察条件の検討を行った。ナトリウムチャネルには、立体構造の安定性を考慮して原核生物Arcobacter butzleri由来のNavAbを用いた。
単粒子解析法は、クライオ電子顕微鏡で観察された粒子を一つ一つ重ね合わせることで、タンパク質の立体構造情報を得る方法である。結合した薬剤を考慮したうえでの重ね合わせができれば、ナトリウムチャネルと局所麻酔薬の正しい結合構造を明らかにできる。正確な重ね合わせを行うためには観察像における不純物を除く必要があり、密度勾配遠心による余分な界面活性剤を除く条件を検討した。これらの検討により、明瞭なイオンチャネル粒子を観察可能な条件を決定し極低温電子顕微鏡による観察像の手動収集により、低分解能ながらもNavAbの三次元再構成像の作成に成功した。今後は局所麻酔薬を添加し複合体を形成した状態での観察像の収集と画像解析により高分解能の複合体構造の解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
解析に用いた粒子は余分な界面活性剤を取り除くための条件検討と観察グリッドの作製条件を含めて検討した。観察された粒子は細胞膜に対して平行な向きの粒子が多く観察されたが、垂直な方向の粒子も少なからず観察された。今回の観察は手動撮影によるデータ収集であるため少ない粒子数での解析であったが、作製した二次元クラス平均像や三次元構造は手低分解能ながらもNavAbの既知の構造と同様の特徴を有していることが確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
界面活性剤の除去法と観察条件を決定することができたので、局所麻酔薬との複合体を形成したNavAb粒子の極低温電子顕微鏡像のデータ収集を行う。今後は自動測定によるデータ収集により解析に用いる粒子数を増やすことでの分解能の向上が期待される。
観察粒子の向きの偏りについては除去する界面活性剤の量の調節やNavAbの細胞内領域を最適化することでの改善を目指す。
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