2020 Fiscal Year Research-status Report
Runx2,3による関節軟骨の統合的制御機構の解明
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20K09451
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
谷口 優樹 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (80722165)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 琢 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (30456107)
大島 寧 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (50570016)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Runx2 / Runx3 / 変形性関節症 / RNAシークエンス / ChIPシークエンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、増え続けている運動器変性疾患の代表例である変形性関節症（OA)の新規治療標的を解明するべく、軟骨を変性させるシグナルの一つである軟骨内骨化の中心に位置する転写因子Runx2およびRunx3の機能解析を目的に各実験を開始している。
最初にWTマウスの解析で、OAが進行してもRunx2は深層で発現が維持されて、Runx3は漸減することが判明した。続いて薬剤誘導性に時期特異的・関節軟骨特異的をノックアウトできるCol2a1-CreERT2マウスとRunx2, 3のfloxマウスを交配させてOAの解析やin vitroでの解析を行った。Runx2はヘテロノックアウトではOAが抑制され、ホモノックアウトではOAが進行するという二層性の変化を示した。Runx3のノックアウトマウスの膝ではOAが進行した。また関節軟骨表層でノックアウトするPrg4-CreERT2;Runx3fl/flマウスでも同様にOAが進行した。さらに各ノックアウトマウスとコントロールマウス由来の軟骨細胞の解析を行った。これに並行して、正常細胞とRunx2, 3のノックアウト細胞との間でRNAシーケンスによる発現量の比較を行った。Runx2は既存の報告通り軟骨基質破壊因子であるMmp13だけでなく、ある特殊な培養条件下で軟骨保護因子であるCol2a1を、誘導することが示唆される結果となった。一方で、Runx3は表層由来の軟骨細胞で関節潤滑に関わるPrg4を、また深層由来の軟骨細胞では軟骨保護因子であるAcanを、それぞれ誘導することが示唆される結果となった。
現在、転写因子であるRunx2とRunx3の軟骨細胞での転写標的を探るべく、ChIPシークエンスを計画している段階である。この解析を行うことで、ゲノムにおいて対象遺伝子のどの部位に、どういった塩基配列にRunx2/Runx3が結合して機能しているのかが明らかになる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初のプランでは、(1)in vivoで関節軟骨の各層におけるRunx2, 3の機能解析、(2)in vitroで関節軟骨の各層におけるRunx2, 3の転写標的の解析、（３）関節軟骨の各層におけるRunx2, 3の共役分子の探索を網羅的に行うことを計画した。
最初にWTマウスに外科的手術を行い、継時的にサンプルを採取して解析したところ、OAが進行してもRunx2は深層で発現が維持されて、Runx3は漸減することが判明した。続いてタモキシフェン誘導性に関節軟骨で対象をノックアウトできるCol2a1-CreERT2マウスとRunx2, 3のfloxマウスを交配させてOAの解析やin vitroでの解析を行った。Runx2はヘテロノックアウトではOAが抑制され、ホモノックアウトではOAが進行するという二層性の変化を示した。Runx3のノックアウトではOAが進行した。また関節軟骨表層でノックアウトするPrg4-CreERT2;Runx3fl/flマウスでも同様にOAが進行した。
この原因としてin vitroでは、各ノックアウトマウスとコントロールマウス由来の軟骨細胞の解析を行った。正常細胞とRunx2, 3のノックアウト細胞との間でRNAシーケンスによる発現量の比較を行い、Runx2が軟骨保護因子に重要なCol2a1を、Runx3は関節潤滑に関わるPrg4を、それぞれ誘導することが示唆される結果となった。まとめると、当初のプランの(2)まで順調に推移している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、上述した通りおおむね順調に経過しているため、現在ChIPシークエンスを効率的に行うためのFLAGタグのついたRunx2, Runx3を発現するベクターを作出している。当初メインに想定していたRunx2/Runx3を標的としたChIPシークエンスを進めていく予定としている。
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| Causes of Carryover |
マウスが安定的にMatingを繰り返して実験サンプルが供給されるようになり、購入試薬の調整がしやすくなった。またRNAシークエンスが当初予定していたより安価で対応できた。
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[Presentation] 脂肪幹細胞を用いた変形性膝関節症治療の臨床成績と、治療効果に関係するMRI所見の検討2020
Author(s)
樋口淳也, 山神良太, 松本卓巳, 前之原悠司, 寺尾友宏, 井上啓太, 辻晋作, 千々松良太, 小俣康徳, 矢野文子, 田中栄, 齋藤琢
Organizer
第19回再生医療学会総会
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