味細胞内味覚受容Caシグナルの生体内イメージングと亜鉛欠乏による味覚障害機序解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09740
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 田中 真琴 日本大学, 医学部, 助教 (00526121)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野村 泰之 日本大学, 医学部, 講師 (20297815) ; 飯野 正光 日本大学, 医学部, 上席研究員 (50133939)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 味細胞 / TRPM5遺伝子 / 味覚障害

Outline of Annual Research Achievements

味覚受容器機構において、味蕾細胞内Ca2+シグナルが重要な役割を果たすことは、細胞・分子レベルの研究で明らかにされてきているが、味覚受容器が生理的な構築を維持した状態でのカルシウムシグナル機構に関しては未知の部分が多く残されている。本研究ではタンパク質型高感度カルシウムインジケーターを用いて、これまでに行われていない生体内での味覚受容器のカルシウムシグナルを計測することを目的としている。
我々は、これまでにCRSPR-Cas9という遺伝子組み換え技術を使用し、味蕾のⅡ型細胞に特異的に存在する膜タンパクであるTransient receptor potential cation channel subfamily M member 5（TRPM5）遺伝子にテトラサイクリンアクチベーターを導入したマウス、TRPM5特異的tetracycline transactivator(tTA)発現マウスの作成に成功した。その完成したマウスをTet-Oシステムを使用した、全身の全細胞に蛍光カルシウムセンサー（YC-NANO50）を持つ遺伝子改変マウスと交配を行い、TRPM5特異的にYC-NANO50発現させたマウス（TRPM5特異的YC-NANO50発現マウス）を作成した。TRPM5特異的YC-NANO50発現マウスの舌を摘出し、免疫染色の手法を用いて味蕾のⅡ型細胞にYC-NANO50が発現していることが確認できた。TRPM5特異的YC-NANO50発現マウスに腹腔内麻酔を行ない、マウスが生きている状態で舌を露出させ、蛍光実体顕微鏡を用いてマウスの茸状乳頭の味蕾が安定的に観察できる実験系を確立した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度は、TRPM5特異的tetracycline transactivator(tTA)発現マウスの作成に難渋したが、今年度に作成に成功したことは順調な進展といえる。
また、生きている状態のマウスの舌の観察に、特殊な開口器を導入することに成功し、実験系の確立が可能となった。現在は確立した実験系を用いてTRPM5特異的YC-NANO50発現マウスの舌に単一の味物質を滴下し、茸状乳頭の味蕾に含まれるⅡ型細胞内でどのようなカルシウムシグナル伝達の変化が起きているのか、ライブイメージングで観察を行なって、良好な観察結果が得られている。

Strategy for Future Research Activity

今後はデータの解析をすすめたうえで、様々な味質を呈示し、Ⅱ型細胞ごとに甘味、苦味、うま味へのⅡ型細胞のなかでも異なる味覚受容体に対応した反応の違いなどを検討を進める予定である。
更には、味覚障害の主な原因とされる亜鉛欠乏が、味細胞のカルシウムシグナル伝達にいかなる変化が生じるのかの解析を進めるために、亜鉛欠乏食で飼育した味覚障害モデルのラットを作成し、それらのラットの舌局所でのカルシウムイメージングを行い、味覚障害の発症機序の解明に帰する研究を進めたい。

Causes of Carryover

本年度は実験系の確立に注力したが、既存の設備を使用することで物品費の使用が少なかった。
また、新型コロナウイルス感染症の影響で、オンラインの学会が多く、旅費の使用が少なかった。次年度はすでに、5月と9月に学会発表を控えており、前年度分を使用する予定である。