EBウイルス遺伝子導入マウスによるシェーグレン症候群発症機構の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09928
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 中山 亮子 鶴見大学, 歯学部, 助教 (50749843)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 直行 鶴見大学, 歯学部, 准教授 (20386080) ; 井上 裕子 日本薬科大学, 薬学部, 教授 (50367306) ; 斎藤 一郎 鶴見大学, 歯学部, 教授 (60147634) [Withdrawn] ; 山崎 智恵 鶴見大学, 歯学部, 学部助手 (80817122) ; 尾曲 大輔 鶴見大学, 歯学部, 助教 (10608699)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 自己免疫疾患 / シェーグレン 症候群 / 唾液 / 女性ホルモン / OVX / EBウイルス

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題はEBウイルス再活性化の指標となるレポーター遺伝子(Zp-Luc)を導入したトランスジェニックマウスを用いた卵巣摘出(OVX)による女性ホルモン低下モデル動物の解析から、EBウイルスの再活性化を介したSSの病態成立機序の解明を目指す。
次年度は、初年度に実施したOVX処置の検証のためにマウス血清中のエストロゲン量を質量分析により測定した。結果、Sham群の血中エストロゲン量10.5pg/mLに対して、OVX群の血中エストロゲン量は0.024pg/mLとなり、OVX処置が正しく行われていることが示された。次に、初年度の実験で有意な唾液分泌の減少が認められたZp-LucマウスのOVX群とSham群について顎下腺の組織学的形態に変化が認められる30週齢まで観察の後唾液腺を摘出し、その組織ライセートを用いてルシフェラーゼアッセイを実施したところ、OVX群の耳下腺組織においてEBウイルス再活性化因子(BZLF1)プロモーターの有意な活性増加を認めた。さらに、Zp-Lucマウスに対しOVXを施す時期とサンプリングのタイミングの検討を中心に実施した。具体的には、生後7週齢での処置後30週齢までの飼育、生後7週齢での処置後10週齢まで飼育、生後10週齢での処置後13週齢まで飼育、生後10週齢での処置後20週齢まで飼育、の4パターンの試験を実施した。生後7週齢でのOVX処置により唾液分泌量の低下がまだ認められない処置後3週(10週齢)でも耳下腺組織においてBZLF1プロモーター活性が有意に増加することが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

BZLF1プロモーター活性が有意に増加する条件の検討のため様々な条件での試験を繰り返す必要があったが、試験に必要なマウス頭数の確保などに時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

BZLF1プロモーターの有意な活性増加が認められた耳下腺組織について組織形態学的な解析として、ホルマリン固定パラフィン包埋の組織切片を作成し、HE染色により組織破壊の程度を検証するとともにリンパ球浸潤の程度のスコアリング解析やAQP5抗体による免疫染色でAQP5の唾液腺の細胞内分布を解析する。さらに、マウス由来SSA/RoおよびSSB/Laリコンビナントタンパクを固相抗原としたELISAによるOVX/Zp-Lucおよびsham/Zp-Lucの血清試料中からの自己抗体検出も実施する。

Causes of Carryover

試験の最適条件の検討に時間を要し、得られた試料の解析まで進めることができなかった。
最終年度は唾液腺組織の解析のために使用する各種アッセイ試薬およびAQP5抗体や蛍光標識二次抗体、自己抗体ELISA検出系の固相抗原としてマウス由来SSA/RoおよびSSB/Laリコンビナントタンパク購入の他、マウスの飼育(特殊飼料、床敷のほか、飼育施設の使用料金)の費用が必要となる。