2020 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of rapid detection method for oral bacterial genes associated with systemic diseases
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20K09940
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
北川 雅恵 広島大学, 病院(歯), 助教 (10403627)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
栗原 英見 広島大学, 医系科学研究科(歯), 名誉教授 (40161765)
宮内 睦美 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (50169265)
長嶺 憲太郎 広島国際大学, 健康科学部, 教授 (80412352)
應原 一久 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (80550425)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 口腔内細菌 / 口腔検査 / cnm / LAMP法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全身疾患と口腔内細菌が関係する研究報告が増加する一方、口腔内細菌の検出さらには検査に至っては研究室レベルに留まっている。これらの情報を社会に有益に還元し、口腔内細菌を臨床的に検査できるようにするためには、検出の簡易化および高感度の検出力が必要と考える。口腔内細菌の検出を考える場合、細菌を検体とし、遺伝子で有無を確認する方法と血液を検体とし、細菌の抗体を検出する方法がある。本研究では、脳内微小出血と関連するcnm遺伝子陽性Streptococcus mutans(S. mutans)をターゲットとして、まず、培養方法の改良によって検体の回収方法を簡単にし、次に、菌のDNAをLAMP法にてより迅速簡便に検出させ、臨床的な応用の可能性を検討する。さらに、血清を用いたELISA法による抗cnm抗体の検出にも挑戦する。これによって、唾液・歯垢あるいは血液検体によってcnm遺伝子陽性S. mutans保菌の有無が確認することができるようになる。
本年度は、LAMP法によるcnm遺伝子迅速・簡易検出法の構築のため、培養法の改良にも取り組み、これまでのプレートによる培養からチューブタイプの培養によりLAMP法によるcnm遺伝子の検出が可能かを検討した。実際に臨床検体でも検出し、その感度の確認を行った。また、ELISA法確立のために、cnm遺伝子陽性S. mutansをマウスへ感染させ、そのモデルマウスからの血清を用いて抗cnm抗体の検出を試みた。しかしながら、S. mutansの感染を確認することはできたが、抗cnm抗体の検出までは至っておらず、次年度引き続き検討・改良を行うこととした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LAMP法によるcnm遺伝子陽性S. mutansの検出のための培養法の改良では、チューブに75 mgのMitis-Salivairius agarにBacitracinを加えた培地を準備し、150μLの唾液を入れ37℃で16時間培養後、DNA抽出せずに、直接反応チューブに加えて65℃、60 min反応させる。感度はプレートタイプと同様に検出でき、cnm遺伝子陰性S. mutansやS. sobrinus、P. ginigivalisは検出されず、cnm遺伝子陽性S. mutans特異的であった。さらに、この方法は唾液を加えてその液を取るだけであるため、プレートタイプの培養から菌を回収するよりも簡単・衛生的であった。臨床検体の陽性率もこれまでの方法と同様に20%程度を示していた。
従来法のPCR法とLAMP法の比較では、唾液102サンプルを用いて検討し、cnm遺伝子陽性S. mutans陽性率はそれぞれ12.7%と26.4%で、LAMP法の感度が優れていることが示された。今後、サンプル数を増やすとともに脳血管疾患だけでなく、他の全身疾患との関連についても検討を行う。
抗cnm抗体検出のためのELISA法の構築においては、cnm遺伝子陽性S. mutansおよびcnm陰性S. mutans、Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)、cnm合成ペプチドを脳出血ラットモデルに歯性感染あるいは歯性投与し、それぞれ血清を採取した。cnm遺伝子陽性S. mutansの凍結乾燥したものを抗原とし、採取した結成を用いて間接法にて抗体cnm抗体の検出を行った。P. gingivalis、cnm合成ペプチド については反応せず、S. mutansについてはcnmの有無に関わらず反応した。
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| Strategy for Future Research Activity |
LAMP法によるcnm遺伝子検出では、ツールとしての構築は完了しており、今後は臨床サンプルを多く集め、脳内微小出血だけでなく、対象者のさまざまな臨床的背景との関連の検討を行なっていき、本方法の臨床的価値を評価する。また、新たな疾患との関連が認められる場合やcnm遺伝子陽性S. mutansの除菌効果などの評価が必要な場合には、改めて臨床データを収集する。
ELISA法については、本年度の研究ではS.mutansを検出してしまったため、cnm陽性者だけを検出できる方法を構築する必要がある。次年度は、ELISA法自体あるいは合成ペプチドの改良を行い、修正を行う。その後、ラットモデルを用いた実験において、cnm遺伝子陽性S. mutans感染治療後の抗体価の変化や脳出血病態の変化を評価する。さらに、臨床血清サンプルでのcnm陽性者の検出およびLAMP法による唾液サンプルを用いた検出との一致率を評価する。
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| Causes of Carryover |
コロナで入手が困難なものや遅延が生じたため。
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