2021 Fiscal Year Research-status Report
脂肪由来幹細胞による唾液腺特異的傷害モデルマウスの組織再生と促進因子の網羅的解析
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20K10002
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
松本 直行 鶴見大学, 歯学部, 准教授 (20386080)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斎藤 一郎 鶴見大学, 歯学部, 教授 (60147634) [Withdrawn]
中山 亮子 鶴見大学, 歯学部, 助教 (50749843)
尾曲 大輔 鶴見大学, 歯学部, 助教 (10608699)
山崎 智恵 鶴見大学, 歯学部, 学部助手 (80817122)
井上 裕子 日本薬科大学, 薬学部, 教授 (50367306)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 唾液腺 / 組織傷害 / 脂肪由来幹細胞 / 間質血管細胞群 / 再生 / 再生医療 / 脂肪幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
唾液腺特異的傷害モデルとして、ジフテリアトキシン（DT）受容体（hHB-EGF）を唾液腺特異的に発現させたトランスジェニックマウス（MUC7p-TRECK）のホモ接合体に対してDTを腹腔内投与し、唾液腺組織傷害と唾液分泌量低下の程度を評価し、脂肪由来幹細胞（ASC）移植による唾液腺組織再生の実験条件を検討した。またASCの供与体（ドナー）としてC57BL/6マウス（6週齢、雄）の鼠径部脂肪組織を切除・細切した後にコラゲナーゼにより分散し、間質血管細胞群（SVF）を単離した。SVFに含まれるASCの存在率を検討するため、文献的に使用頻度の高い蛋白プロファイルであるSca-1およびCD34をマーカーとしたフローサイトメトリーを実施した。
これらの実験から下記の結果を得た。(1) MUC7p-TRECKのホモ接合体ならびにヘテロ接合体に対して腹腔へDT（50 - 500 ng/Kg）を投与したところ、唾液分泌量がDT投与前に比べ約47%まで有意に低下した。(2)唾液腺組織の顆粒導管細胞と周囲の腺房細胞にTUNEL陽性の細胞集塊が観察され、DT誘導性の細胞死を確認した。(3)DT投与群はコントロール（生理食塩水投与群）に比べて細胞核内にgamma-H2A.X陽性のfociが増加し、細胞死にDNAダメージが関連していることが示唆された。(4)SVFは継代培養を進めるに伴い、細胞形態が短紡錘形から細胞質の広い大型の細胞へ変化し、急激に増殖能が低下したことから、細胞の分化ないし老化が生じていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染症の蔓延に伴う物品の供給停止の影響により研究の遂行に遅延が発生した。唾液腺組織傷害を評価するため唾液腺組織特異的傷害モデルとしてMUC7p-TRECKマウスを用いているが、研究に十分な頭数のホモ接合体を得るのに当初の予定よりも期間を要した。またSVF群に含まれる細胞が継代培養の早期に分化ないし老化を示すことから細胞の分取・培養に係わる条件を再検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
MUC7p-TRCKマウスによる唾液腺傷害モデルは概ね確立されたことから、SVFならびにASCの分取・培養プロトコールを最適化し、幹細胞移植に十分な量のASC確保を目指す。また得られたASCを唾液腺傷害モデルマウスに移植した後、組織の再生を形態学的（TUNEL陽性細胞および細胞死関連因子の発現・局在）に解析し、さらに唾液の定量的・定性的解析（唾液分泌量、総タンパク量やEGFR-2アゴニスト量等）を実施する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の蔓延に伴う物品の供給停止や、実験に必要な遺伝子改変マウスの確保に期間を要したこと等から、研究の遂行に遅延が発生した。上記の理由により当初の予定使用額と差異が生じたので、差分を次年度に繰り越す。
遅延した研究を遂行するために、SVFならびにASC分取・培養プロトコールの最適化に供すマウスならびに試薬、得られたSVFならびにASCの生物学的なプロファイルを検討するために実施するflow cytometryの試薬、組織再生の組織学的・分子生物学的解析と唾液の定量的・定性的解析に必要な試薬を購入する。
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