2021 Fiscal Year Research-status Report
Functional Interaction between MRE11 and ATM in cytoplasmic stress responses
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20K12162
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
小林 純也 国際医療福祉大学, 成田保健医療学部, 教授 (30301302)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ストレス応答 / 酸化ストレス / 脳神経変性 / ATM / MRE11 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放射線高感受性遺伝病A-TとATLDでは、その原因遺伝子ATM, MRE11が放射線誘発DNA損傷応答に重要な機能を持つことが明らかとなってきているが、これら遺伝病患者が示す進行性小脳失調症の発症機構はいまだ明らかとなっていない。本研究課題ではその発症メカニズムに迫るために、近年これら遺伝子の役割が明らかにされつつある細胞質内ストレス応答経路におけるATMとMRE11の役割・機能的相互作用を脳神経幹細胞・血管内皮細胞を用いて明らかにすることを目的の根幹とし、さらに応答時のATM, MRE11との結合因子をプロテオミクス解析で同定、機能解明し、進行性小脳失調の発症機構の解明を目指すものである。
令和2年度に血管内皮細胞においてDIAプロテオーム解析で低線量率照射依存的に発現変化するとして同定した蛋白質について、ミトコンドリア機能阻害剤Pyocyaninによる酸化ストレス誘導処理でウェスタンブロット法で検討すると、SMC4, DNMT1の減少（DNA損傷では顕著な変化無し）、SOS2の増加が確認され、低線量率放射線と酸化ストレスとで共通した応答機能が示唆され、このようなストレス制御に関与するATM, MRE11との関係性も示唆された。
さらに繊維芽細胞での低線量率照射時において検討し、ATMを阻害すると酸化ストレス蓄積が増加するとともに、微小核形成が低線量率照射時でのみ顕著に増加し、ATM阻害剤使用によりミトファジーの誘導に影響が見られたことから、低線量率照射における酸化ストレス誘導、ミトファジー活性化、微小核形成という一連の細胞応答でのATMの機能の重要性が予想され、MRE11の関与も考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度DIAプロテオーム解析した因子について、低線量率照射だけでなく、酸化ストレス誘導処理でも応答が確認でき、様々な細胞質内ストレス応答に対する指標となるマーカーが得られ、まだ解析途上の因子も含め、様々なストレスでの反応性を確認することによりストレス応答の共通機構が明らかに出来ると考えられること、また、ATMが広く酸化ストレス応答の中心制御因子であることが確認でき、今後ミトファジーでの役割やMRE11の関与が検討すれば、ATM, MRE11の細胞質内ストレス応答による役割を解明することにつながると考えられ、令和3年度研究は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
DIAプロテオーム解析で同定した因子について、引き続き様々なストレス（特に細胞質内ストレス）における反応性をウェスタンブロット法で検討し、応答の共通性を解明するとともに、これら因子のATM, MRE11との関係性について、物理的相互作用があるかを免疫沈降法で検討し、ATM阻害剤やsiRNAノックダウンを行って、ストレス誘導処理を行って、同定因子の発現変化を血管内皮細胞、ヒト繊維芽細胞で検討を進める。
ATMとMRE11の機能的な関係の解明では、免疫沈降法を用いて、ストレス誘導（細胞質内ストレスで特にミトファジーを誘導しうる条件で）時の物理的相互作用を免疫沈降法で検討するとともに、免疫蛍光染色法で、細胞質内での動態、相互作用を検討する。
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| Causes of Carryover |
本課題の研究代表者小林が令和2年4月に所属機関を京都大学から国際医療福祉大学へと異動し、異動後に研究・実験環境のセットアップ、研究再開に相当の時間が必要であった中、さらにコロナ禍で研究環境整備に大幅な遅れが生じ、実験室での研究開始が令和2年年度後半となり、さらに令和3年度では前年度の研究の遅れを補うために、研究の精力的な遂行を計画したが、前年度同様コロナ禍が続いたため、国内外の関連研究室の訪問・情報収集を踏まえての研究展開ができず、研究費の使用が計上額と比べて大幅に少なくなった。令和4年度はコロナ禍がおさまりつつあり、国内外の関連研究室との交流・情報交換も十分に可能なことから、精力的に研究展開し、前年度までの計上額も含め研究費を使用する予定である。
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