相同組換えによる照射線傷害の修復とその失敗で起きる二次的な二重鎖切断部位の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K12166
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 花田 克浩 大分大学, 医学部, 助教 (90581009)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西田 欣広 大分大学, 医学部, 准教授 (10336274) ; 寺林 健 大分大学, 医学部, 助教 (40452429)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 相同組換え

Outline of Annual Research Achievements

この研究は、『相同組換え』の後半部分のメカニズムを解明することと、その修復の失敗が原因となって二次的に生じる二重鎖切断の発生部位を解明することの２つを目標としている。『相同組換え』の後半部分のメカニズムとして、Holliday構造を介する『DSB修復経路』と、 一本鎖どうしの相補配列間の会合を介する『SDSA経路』の２つが存在することが知られているが、哺乳類細胞では、その経路がどのように選択されるのか解明されていない。相同組換えの後半部分の反応において、どのように組換え経路が決定され、反応は完結するか、そのメカニズムを解明する。特に体細胞での『DSB修復経路』に関する知見が少ないため、『DSB修復経路』への誘導因子の同定を目指す。
当該年度の研究から、組換え中間体への作用し、組換え経路の選択に寄与している可能性が示唆されているRAD54に関して、RAD51をDNAから解離させる条件の設定に成功した。また、その他の因子と考えられているRecQファミリー(BLM, WRN, RECQL5)、とPARI、RAD51AP1とHolliday構造を解消するGEN1について、昆虫細胞発現系のベクターにクローニングし、バイキュロウイルスの作成と過剰発現の条件設定を終了した。現在、これらの組換えタンパク質の精製作業を行っている最中である。
さらに、相同組換えの後期過程に関わる因子の遺伝子を欠損したマウスES細胞株、チャイニーズハムスター由来の遺伝子変異株、ヒト遺伝子変異株の細胞株を入手、または、作成した。今後は、これらの細胞を用いて、相同組換えの失敗が原因となって二次的に生じる二重鎖切断の発生部位を解明する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度は、相同組換えに関わる酵素の精製と反応の至適条件を決定することを最低限の到達目標としていたが、RAD54タンパク質がRAD51タンパク質をDNAから解離させる条件の設定に成功したので、目標は達成できた。それ故に生化学的実験に関しては概ね順調であると判断した。現在、RAD54B, FBH1についても同様な検証作業を行なっており、至適条件の設定はほぼ終了している。また、その他の因子と考えられているRecQファミリー(BLM、WRN、RECQL5)、とPARI、RAD51AP1について、組換えタンパク質発現用のバキュロウイルスの作成が終了した。WRNについては、ヘリカーゼドメインのおよびヌクレアーゼドメインの双方に関して、活性が失活した変異タンパク質の発現系も作成した。次の段階として、Holliday構造を解消するGEN1、MSU81-EME1/2、XPF-ERCC1について、MSU81-EME1/2、XPF-ERCC1のヌクレアーゼ変異を導入したタンパク質を発現できるcDNAを昆虫細胞発現系のベクターにクローニングし、バイキュロウイルスの作成と過剰発現の条件設定を終了した。現在、これらの組換えタンパク質の精製作業を行っている。
相同組換えの失敗が原因となって二次的に生じる二重鎖切断の発生部位を解析については、パルスフィールド電気泳動のゲルから高分子のDNAを回収するのに難航しており、計画より少々遅れ気味であるが、パルスフィールド用ではない低融点のゲルを使うことで、この問題を解決できそうな目処が立ってきたので、今後も条件検討を続ける。

Strategy for Future Research Activity

今後は、新たに精製するBLM、WRN、RECQL5、PARI、RAD51AP1について、RAD54やRAD54Bと同様にDNAに結合したRAD51を解離させるか、その検証を行う。また、各因子に関してRAD51が解離した後のDNAがD-loopからHolliday構造への移行する反応を補助する因子を同定していく。
次に、Holliday構造を解消するGEN1、MUS81-EME1/2、SLX1-4、XPF-ERCC1について、タンパク質を精製して、上記の反応で作成されたDNAに対してどのように作用するか検証し、D-loopを解消する酵素とHolliday構造を解消する酵素との分類を行いたい。
また、今年度から、相同組換えによる二重鎖切断修復の失敗が原因となって起きる二次的な二重鎖切断の発生部位の解析に関して、その条件検討を行う。まずは、放射線照射後、放射線の直接的作用によって生じる二重鎖切断の切断部位を解析することを目指す。一方、MUS81、XPF、ERCC1の変異細胞は既に有しているので、それらでの二重鎖切断部位についても解析する。また、今年度にゲノム編集技術を使ってGEN1の変異細胞を作成する。もし、早期にGEN1変異細胞が作成できたら、放射線照射後のDNA切断部位を解析する。

Causes of Carryover

当該年度は、新型コロナウイルス感染拡大の影響で、次世代シーケンサー関連の研究指導を受けるための出張を行わなかった。そのため旅費を使用しなかった。それにより、次世代シーケンサーを用いた解析を次年度以降に実施することにした。
次年度の予定として、研究を加速させるために、学生の研究補助を雇うことにした。その謝金分（月２万円×１１ヶ月）を計上する。また、次世代シーケンサーの関連試薬（約３０万円）とパルスフィールド電気泳動関連（１０万円）を次年度に使用する。
その他の部分は当初の計画通りで、本年度の配分予定分である予算（６０万円）から購入を予定している。生化学解析関連に３０万円、出張が可能な場合につき、旅費１０万円、その他の経費として論文出版経費２０万円を計上したい。出張が不可能な場合、物品費に振替え、研究を加速させる。