2020 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of biofilm formation in nitrifying and denitrifying bacteria and its application
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20K12229
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| Research Institution | Aichi Institute of Technology |
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Principal Investigator |
西村 聡子 愛知工業大学, 工学部, 准教授 (90609322)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
飯島 信司 愛知工業大学, 工学部, 教授 (00168056)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 生物的硝化・脱窒 / アンモニア酸化細菌 / 脱窒菌 / バイオフィルム / 環状ジヌクレオチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生活廃水・工業廃水中に含まれる窒素化合物は河川や湖沼、内海の富栄養化の原因物質であり、大きな環境問題となっている。これらの窒素化合物を処理する方法として、微生物を用いた生物学的硝化・脱窒法が広く利用されている。本研究は、窒素化合物の生物学的処理において重要な役割を果たすアンモニア酸化細菌Nitrosomonas europaea、および脱窒菌Paracoccus denitrificansのバイオフィルム形成制御機構を明らかにすることで、生物的硝化・脱窒の高効率化を実現することを目的とする。
１）アンモニア酸化細菌について
アンモニア酸化細菌N. europaeaは難培養性であるため、まず培地や培養条件の検討を行い、安定した培養方法を確立した。またアンモニア酸化細菌のバイオフィルム形成と硝化作用の関係を検討することを目的として、多くのグラム陰性菌でバイオフィルム形成を制御していることが知られる環状ジグアニル酸の効果を検討した。バイオフィルム形成条件について検討を行い、クリスタルバイオレット染色法および共焦点顕微鏡観察によりバイオフィルム形成を確認した。また環状ジグアニル酸のバイオフィルム形成に対する効果を検討すると共に、環状ジグアニル酸合成酵素・分解酵素の遺伝子解析を行い、これらの遺伝子のクローニングを進めた。
２）脱窒菌について
脱窒菌P. denitrificansのバイオフィルム形成条件について検討し、好気性および嫌気性条件下でのバイオフィルム形成を確認した。また環状ジグアニル酸のバイオフィルム形成に対する効果を検討すると共に、定量ＰＣＲを用いて環状ジグアニル酸合成・分解酵素遺伝子や脱窒に関わる遺伝子の発現を検討した。今後、これらの遺伝子の発現制御について検討すると共に、環状ジグアニル酸合成酵素・分解酵素のクローニングを進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）難培養性であるアンモニア酸化細菌N. europaeaの培養方法を確立し、クリスタルバイオレット色素を用いたバイオフィルム定量法および共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析により、N. europaeaのバイオフィルム形成を確認した。またN. europaea NCBI 14298株の環状ジグアニル酸（c-di-GMP）合成酵素・分解酵素の遺伝子を解析し、GGDEFを含むc-di-GMP合成酵素遺伝子、EALを含むc-di-GMP分解酵素遺伝子、GGDEFとEALの両方を含む遺伝子が存在することを明らかにした。これらの遺伝子の転写レベルでの発現を確認し、まずGGDEFを含むc-di-GMP合成酵素遺伝子についてクローニングを進めた。
２）脱窒菌P. denitrificansのバイオフィルム形成条件について検討し、好気性および嫌気性条件下でのバイオフィルム形成を確認した。P. denitrificansは嫌気性条件下で脱窒を行うことが知られているが、定量ＰＣＲを用いて脱窒過程やその調節に関わる遺伝子の発現を検討した結果、好気性条件においてもこれらの遺伝子がわずかながら発現していることが確認された。またc-di-GMP合成・分解酵素の遺伝子検索から、二つのc-di-GMP合成酵素と二つの分解酵素遺伝子の存在を明らかにし、これらの転写レベルでの発現を確認した。現在これらのクローニングを進め、またP. denitrificansへの遺伝子導入法の検討を行っている。
これらのことから、おおむね計画通り推移している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）アンモニア酸化細菌N. europaeaについて、すでにクローニング済みであるc-di-GMP合成酵素遺伝子を大腸菌に導入し、酵素活性を確認する。その他の遺伝子についてもクローニングを進め、同様に酵素活性の検討を行う。またHPLCやELISA法を用いた細胞内c-di-GMP濃度の測定法を確立し、環状ジグアニル酸とバイオフィルム形成および硝化能との関連を検討する。
２）脱窒菌P. denitrificansのc-di-GMP合成酵素・分解酵素のクローニングを進め、その酵素活性を検討する。その知見を元に、これらの遺伝子の過剰発現株あるいはノックダウン株を作成するため、遺伝子導入法の検討を行う。これらを導入した細菌株を作製した後、バイオフィルム形成能や脱窒能の検討を行うと共に、定量ＰＣＲによりバイオフィルム関連遺伝子、脱窒過程やその調節に関わる遺伝子の発現変化を解析する。これらの検討により、環状ジグアニル酸のバイオフィルム形成および脱窒能への関与を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
2020年度の計画として学会参加費および旅費を見込んでいたが、発表学会を2021年度春の学会（日本生化学会中部支部例会・シンポジウム）に変更したため、2020年度はそれらの費用が不要となった。そのため使用計画を変更した。
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