2023 Fiscal Year Research-status Report
条鰭類の進化モデルを用いた下垂体神経葉への軸索誘導因子の同定
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20K15834
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
東 森生 自治医科大学, 医学部, 講師 (90709643)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 下垂体神経葉 / 下垂体ホルモン / メラニン凝集ホルモン / 軸索誘導因子 / 条鰭類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
条鰭類の魚種では一般に、下垂体神経葉にメラニン凝集ホルモン（MCH）ニューロンの軸索が投射し、MCHを血中に放出して体色を明化させる。申請者は、現生条鰭類で最初期に分岐したポリプテルスではMCHニューロンが投射しないこと、チョウザメではMCHニューロンが神経葉に投射することを発見した。本研究はポリプテルスとチョウザメのMCHニューロンに発現する遺伝子の違いを明確にし、ニューロンの軸索が神経葉に投射する仕組みを探ることを目的に実施した。
令和5年度では、チョウザメMCHニューロンに特異的な遺伝子を特定するため、プライマー交換反応によるDNA伸長を利用したsignal amplification by exchange reaction-fluorescence in situ hybridization (SABER-FISH法) により、脳組織において低発現遺伝子の発現を多重染色で可視化し、精査した。さらに、酵素非依存的なDNA増幅反応を利用するin situ hybridization chain reaction（isHCR）をポリプテルスやチョウザメ脳より分散したニューロンに適用し、可視化したMCH mRNA発現ニューロンを単離することに成功した。単離したニューロンからRNA抽出を行った後、各魚種由来のMCH mRNA発現ニューロンに発現する遺伝子を定量的PCRにより検出し、in situ hybridizationでは検出できない低発現の遺伝子を比較することで魚種間の違いをより明確にした。
令和6年度では、引き続きSABER-FISH法とisHCRを利用してチョウザメMCHニューロンに特異的な遺伝子の特定を進め、神経葉への軸索誘導に関わる可能性のある遺伝子を欠損させたゼブラフィッシュの表現型解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでに実施したトランスクリプトーム解析結果を利用し、MCHニューロン特異的な遺伝子を特定するためにin situ hybridization法により詳細な組織学的解析を実施した。低発現遺伝子の多重染色のためにsignal amplification by exchange reaction-fluorescence in situ hybridization (SABER-FISH法) を導入し、検出感度を増感して蛍光観察が可能となった。さらに、酵素非依存的なDNA増幅反応を利用するin situ hybridization chain reaction（isHCR）を導入し、分散したMCH mRNA発現ニューロンを可視化後に単離して、遺伝子発現を探った。
実験施設におけるSABER-FISH法やisHCRの立ち上げのために時間を要したため、当初の研究計画予定よりもやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度では令和5年度に引き続き、下記の予定で進める。
【①神経葉に投射するMCHニューロンに特異な発現遺伝子の同定】高感度in situ hybridization法であるSABER-FISH法による二重染色やisHCRにより可視化したMCH mRNA発現ニューロンにおける遺伝子発現を探り、チョウザメの神経葉に投射する大型のMCHニューロンに特異な発現遺伝子を同定する。
【②遺伝子欠損ゼブラフィッシュの作製と対象遺伝子の機能解析】CRISPR/Cas9システムを用いて、神経葉に投射するMCHニューロンに特異な遺伝子を欠損したゼ
ブラフィッシュを作出する。次に、胚のMCHニューロンをホールマウント免疫染色で可視化し、共焦点レーザー顕微鏡で撮影した連続画像からニューロンの形態
を三次元構築し、軸索投射領域の変化を調べる。
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| Causes of Carryover |
【理由】これまでに実施した網羅的遺伝子解析結果から選別した遺伝子に関して、MCHニューロンに発現する遺伝子の同定を進めている。その過程で、低発現遺伝子でも多重染色による細胞同定が可能であるsignal amplification by exchange reaction-fluorescence in situ hybridization (SABER-FISH法) を新たに導入した。さらに、酵素非依存的なDNA増幅反応を利用するin situ hybridization chain reaction（isHCR）を導入し、分散したMCH mRNA発現ニューロンを可視化後に単離して、遺伝子発現を探った。実験施設におけるSABER-FISH法やisHCRの立ち上げに時間を要し、研究計画の一部を次年度にも実施するための研究費として使用する。
【研究計画：MCHニューロンに発現する遺伝子の同定】高感度in situ hybridization法であるSABER-FISH法による二重染色やisHCRにより可視化したMCH mRNA発現ニューロンにおける遺伝子発現を探り、チョウザメの神経葉に投射する大型のMCHニューロンに特異な発現遺伝子を同定する。また、MCH発現に関わる可能性のある転写因子遺伝子の発現も探る。
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