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2021 Fiscal Year Research-status Report

Suppression of oxidative stress by protein-protein interaction between cytochrome P450 and UDP-glucuronosyltransferase

Research Project

Project/Area Number 20K16045
Research InstitutionSojo University

Principal Investigator

宮内 優  崇城大学, 薬学部, 講師 (50799947)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords薬物代謝酵素 / シトクロムP450 3A4 / bac-mam system / 哺乳動物細胞 / バキュロウイルス / UDP-グルクロン酸転移酵素 / 糖化産物 / 終末糖化産物受容体
Outline of Annual Research Achievements

申請者は、薬物代謝酵素シトクロムP450 (P450, CYP)とUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)のタンパク質間相互作用に関する研究に従事してきた。その中で、ヒト主要UGT分子種であるUGT2B7が、CYP3A4から産出される過酸化水素の量を減少させることを見出した (Miyauchi et al, Mol Pharmacol, 2015)。過酸化水素は有害な酸化ストレスを引き起こすことから、P450-UGT相互作用の生理学的な意義は、P450に起因する酸化ストレスの低減ではないかと仮定し、本研究でその解明を目指した。
P450-UGT相互作用の解析において重要になるのが共発現系の構築である。先行研究では、バキュロウイルス-昆虫細胞発現系を用いてP450とUGTを共発現させたが、より生体に近いモデルである哺乳動物細胞の方が、生理学的な意義の検討には適している。しかし、一般的な遺伝子導入方法である、トランスフェクション試薬を用いたプラスミドの導入だけでは、P450とUGTの発現レベルをコントロールすることが困難であった。そのため、新たな遺伝子導入方法として、哺乳動物細胞内で目的タンパク質の発現が可能な、baculovirus-mammalian cell expression system (bac-mam system)に着目し、アフリカミドリザルの腎由来細胞であるCOS-1細胞にCYP3A4を発現させる条件を検討した。最適化条件でウイルスを感染させ、調製したセルライセートにはCYP3A4活性が認められた。これは、薬物代謝酵素の研究におけるbac-mam systemの有用性を示すものであり、今後の研究への応用が期待される。
また、上記の研究から派生して、酸化ストレス誘導作用が報告されていた糖化産物ジヒドロピラジンの毒性発現機構も検討し、成果を論文として発表した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画とは異なるものの、bac-mam systemを用いたCYP3A4発現系の構築と、糖化産物ジヒドロピラジンの毒性発現機構について、論文として発表することができた。さらに、P450-UGT相互作用について、招待総説を執筆するなど、多くの実績を残すことができた。
一方、哺乳動物細胞を用いた別の発現系として、ドキシサイクリンにより発現制御が可能なTet-One systemに着目し、P450およびUGT遺伝子のサブクローニングを計画した。この系で用いるプラスミドの調製には、より大きな培養スケールに対応できる遠心機が必要だったため、新たに購入したところ、世界的な感染症拡大の影響に加え、欧州の動乱の影響により納品が年度末になってしまった。これによりサブクローニングが思うように進まず、コンストラクトの完成には至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

遠心機の納品遅延により、Tet-One systemを用いた薬物代謝酵素発現系の構築は、予定通りには進まなかった。研究期間を延長し、サブクローニングを完了するところまでは進めたいと考えている。また、本研究で構築したbac-mam systemをプラスミドのトランスフェクションと組合せることで、P450とUGTの遺伝子を別々の手法で培養細胞に導入することが可能になった。今後、P450-UGT相互作用の研究を発展させるためにも、この組み合わせによりP450とUGTの発現量のコントロールが可能かどうか、検討を続けたい。

Causes of Carryover

業者の見積金額と実際の支払額に差が生じたため、1円の残金が生じた。この残金は2022年度末の本研究課題終了時に返納する。

  • Research Products

    (11 results)

All 2022 2021 Other

All Journal Article (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 3 results) Presentation (7 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Use of a Baculovirus-Mammalian Cell Expression-System for Expression of Drug-Metabolizing Enzymes: Optimization of Infection With a Focus on Cytochrome P450 3A42022

    • Author(s)
      Miyauchi Yuu、Kimura Akane、Sawai Madoka、Fujimoto Keiko、Hirota Yuko、Tanaka Yoshitaka、Takechi Shinji、Mackenzie Peter I.、Ishii Yuji
    • Journal Title

      Frontiers in Pharmacology

      Volume: 13 Pages: ー

    • DOI

      10.3389/fphar.2022.832931

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Molecular mechanism of dihydropyrazine-induced cytotoxicity: the possibility of an independent pathway from the receptor for advanced glycation end products2021

    • Author(s)
      Miyauchi Yuu、Sawai Madoka、Ishida Takumi、Kansui Hisao、Takechi Shinji
    • Journal Title

      The Journal of Toxicological Sciences

      Volume: 46 Pages: 509~514

    • DOI

      10.2131/jts.46.509

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Functional Interaction between Cytochrome P450 and UDP-Glucuronosyltransferase on the Endoplasmic Reticulum Membrane: One of Post-translational Factors Which Possibly Contributes to Their Inter-Individual Differences2021

    • Author(s)
      Miyauchi Yuu、Takechi Shinji、Ishii Yuji
    • Journal Title

      Biological and Pharmaceutical Bulletin

      Volume: 44 Pages: 1635~1644

    • DOI

      10.1248/bpb.b21-00286

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 糖化産物ジヒドロピラジン類による細胞毒性の機構解明:終末糖化産物との相違点2022

    • Author(s)
      宮内 優, 澤井円香, 石田卓巳, 寒水壽朗, 武知進士
    • Organizer
      日本薬学会第142年会
  • [Presentation] ジヒドロピラジンによる細胞毒性の分子機構解明:終末糖化産物受容体の寄与2021

    • Author(s)
      宮内 優, 澤井円香, 石田卓巳, 寒水壽朗, 武知進士
    • Organizer
      第48回日本毒性学会学術年会
  • [Presentation] ジヒドロピラジンによる細胞毒性に終末糖化産物受容体が及ぼす影響2021

    • Author(s)
      宮内 優, 澤井円香, 石田卓巳, 寒水壽朗, 武知進士
    • Organizer
      フォーラム2021衛生薬学・環境トキシコロジー
  • [Presentation] UDP-グルクロン酸転移酵素研究の基盤: 小胞体局在機構、機能発現、およびシトクロムP450機能調節2021

    • Author(s)
      宮内 優
    • Organizer
      フォーラム2021衛生薬学・環境トキシコロジー
  • [Presentation] Heterologous expression of UDP-glucuronosyltransferase in COS-1 cells with an episomal vector2021

    • Author(s)
      Miyauchi Y., Mackenzie P.I., Ishii Y., and Takechi S.
    • Organizer
      日本薬物動態学会第36回年会
  • [Presentation] 糖化産物中間体ジヒドロピラジン類の細胞毒性機構解明:終末糖化産物関連受容体の関与2021

    • Author(s)
      宮内 優, 澤井円香, 石田卓巳, 寒水壽朗, 武知進士
    • Organizer
      第38回日本薬学会九州山口支部大会
  • [Presentation] タンパク質間相互作用による薬物代謝酵素の制御機構2021

    • Author(s)
      宮内 優
    • Organizer
      第38回日本薬学会九州山口支部大会
  • [Remarks] 崇城大学教員データベース

    • URL

      http://rsrch.ofc.sojo-u.ac.jp/sjuhp/KgApp

URL: 

Published: 2022-12-28  

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