2020 Fiscal Year Research-status Report
癌関連線維芽細胞におけるサイトカイン制御因子を標的とした新規治療法の開発
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20K16352
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
塚越 真梨子 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60781317)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 癌関連線維芽細胞 / 肝癌 / 癌微小環境 / GPR68 / サイトカイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、癌の微小環境における癌細胞と間質との相互作用の重要性が報告され、治療標的として注目されている。我々は癌間質の主な構成要素である癌関連線維芽細胞(CAF)に注目し、これまでに肝癌CAFの活性化をConophyllineが抑制すること明らかにした。Conophyllineによりサイトカイン産生が抑制され、その制御にその制御にプロトン受容体の1つであるG protein-coupled receptor 68(GPR68)が関与する可能性が示された。本研究ではGPR68に注目して肝癌の進展および免疫抑制環境構築に与える影響を検討し、癌微小環境におけるGPR68の制御による新たな治療戦略を開発することを目的とした。
これまでの研究では、ヒト肝癌切除標本より樹立したCAFを用いて、in vitroにおいて機能解析を行った。その結果、肝癌CAFにおけるGPR68は、細胞培養液の弱酸性刺激により発現量が変化し、CAF増殖能の変化を認めた。またGPR68をsiRNAで抑制すると、サイトカイン産生能が抑制されることが明らかとなった。さらにGPR68抑制による肝癌細胞の機能解析を行ったところ、GPR68を抑制すると、CAFによる肝癌細胞増殖抑制効果および浸潤促進効果が抑制された。これらの結果から、GPR68によるサイトカイン分泌制御作用により、肝癌CAFの活性が抑制され、肝癌の発現あるいは進展が抑制できる可能性が示された。肝癌においてGPR68は新たな治療ターゲットとなる可能性があり、今後さらなる解析をすすめていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験系の確立にやや時間を要したがin vitroでの解析を進めている。
① in vitro系でのGPR68発現評価およびpH応答性解析：ヒト肝癌切除標本より樹立したCAFおよびLx-2(ヒト肝星細胞株)においてタンパクレベル(Western blot)においてGPR68が発現することを確認した。次にpH応答性を解析するため、培養液をpH7.2～6.4まで5段階に調整し、弱酸性pH刺激によるCAFおよびLx-2の発現を解析した。肝癌CAFにおいて、弱酸性刺激によりGPR68はタンパクレベルにて減少したが、mRNAレベルにおいては発現増加を認めた。肝癌CAFの増殖能を検討したところ、弱酸性刺激後48時間においてに、増殖能の有意な低下を認めた。Lx2についても同様の検討を行ったところ、タンパクレベルおよび増殖能について、弱酸性刺激による有意な低下を認めた。② GPR68抑制による効果の検証
：GPR68をsiRNAで抑制し、サイトカイン(IL-6, CCL-2, Osteopontin, Angiogenin, IL-8)産生の変化を検証した。GPR68を抑制すると、IL-6, Osteopontin, Angiogenin, IL-8の産生が有意に抑制された。③ GPR68抑制による肝癌細胞の機能解析：GPR68をsiRNAで抑制したCAFの培養上清を用いて、肝癌細胞株（HepG2,PLC）の増殖能を検討した。GPR68を抑制すると、CAFによる肝癌細胞増殖抑制効果が抑制された。またGPR68抑制によりCAFの浸潤促進効果が抑制された。
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| Strategy for Future Research Activity |
In vitroでの弱酸性刺激によるサイトカイン産生の変化を測定しpH応答性を検証する。またin vitroのGPR68抑制実験結果に基づき、専門知識および技術をもつ研究機関との協力体制のもと、免疫抑制性細胞の機能解析やin vivo解析、さらに阻害剤の有用性について研究をすすめる。
①in vitro系でのpH応答性解析：弱酸性刺激によるCAFのサイトカイン産生能変化を検証する。② GPR68抑制による免疫抑制性細胞の機能解析：GPR68をsiRNAで抑制したCAFの培養上清を用いて、免疫抑制性細胞の機能解析（遊走能評価）を行い、GPR68が免疫抑制環境の構築に関与するか検証する。③ in vivoにおけるGPR68の作用の検討：GPR68を含めたOGR1ファミリーGタンパク共役受容体の欠損マウスを用いた研究や腫瘍形成モデルでの解析が進んでいる。GPR68ノックアウトマウスを用いて、肝癌の増殖や治療効果の差を検証する。④ GPR68阻害剤の開発：GPR68受容体を直接的に遮断するような適切な阻害物質を開発し、治療薬としての有用性を検証する。既存の制癌剤との併用による治療効果増強や、免疫チェックポイント阻害剤との相乗効果などを検討する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの流行に伴い、研究に関わる物品の準備に時間を要し、また研究室への立ち入り制限のために当初の研究計画に遅れが生じたため。
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