エクソソームを利用した過酸化チタンナノ粒子による新規放射線増感療法の基礎的検討

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16700
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 岩下 和真 神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (80850065)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: エクソソーム / チタンナノ粒子

Outline of Annual Research Achievements

①エクソソームの単離
Miapaca-2細胞をT75FK内培地で培養し、Exosome free培地に交換して放射線照射を行った。48時間後に3200rpmで10分間遠心分離し細胞上清のみを回収した。その後超遠心機を用いて30000RPMで1時間半遠心分離を2回行い、超遠心後の上清を捨てて底に残ったPBSを回収した。タンパク定量を行いエクソソームの単離を確認した。
②エクソソームに過酸化チタンナノ粒子(TiOxNPs)を包含
TiOxNPsを採取したエクソソーム内に包含させるために、直接透過を促進する手法として電気穿孔法（エレクトロポレーション）を採用することとした。細胞に外部から電場を印加することで一時的に膜透過性を向上させ、エンドサイトーシスを介さずに物質を細胞内部に直接送達する手法のため、実現できれば高い送達効率が期待できる。TiOxNPs 0.1mg/ml, エクソソーム 3μg/well, Au 1μ.mlを添加して数種類のサンプルを作成した。添加時間は24時間としすべての量をPBSで調整した。エレクトロポレーションあり、なしでそれぞれ観察を行った。エレクトロポレーションはPoring pulseとして100V 5mmec 2回、Transfer pulseとして20V 50msec 5回を行った。結果としてはエレクトロポレーションを行うことでエクソソームが細胞死を生じてしまい、TiOxNPsをエクソソーム内に包含することはできなかった。
またエクソソームのサイズが直径50-150nmと一定でないこともあり、TiOxNPsをを体内に運搬する別の方法も現在探索中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

現在までの進捗状況は当初の予定よりも遅れている。エクソソームを単離することには成功しているが、エクソソームに過酸化チタンナノ粒子(TiOxNPs)を包含する方法の確立に難航している。エレクトロポレーションによる直接透過が最も効率の良い送達方法であると考えたため実行したが、TiOxNPsが想定通りにはエクソソームに取り込まれず、エレクトロポレーションによりエクソソームが細胞死を起こしていた。また単離したエクソソームのサイズが一定でないためTiOxNPsを包含するにはサイズが不足している可能性も考えられる。
最適な電場を探索するとともに、TiOxNPsを体内に運搬するための他の方法についても現在検討している状況である。

Strategy for Future Research Activity

TiOxNPsをエクソソームに包含するためにエレクトロポレーションの最適な電場を探索するとともに、エレクトロポレーション以外に包含する方法を探索中である。またTiOxNPsを体内に運搬する別の方法としてAPS(Antibody Polyphenol System)に現在着目している。タンニン酸とタンニン酸をタンパク質もしくは抗体が架橋し三次元的な構造を作るものである。放射線抵抗性のがん幹細胞の表面抗原を認識した選択的結合が他施設ですでに報告されている。特定の抗体やタンパク質を組み込んだAPSでナノ粒子をコーティングして、ナノ粒子に腫瘍への輸送機能や腫瘍滞留性向上機能を付加することができないか、現在検討している状況である。

Causes of Carryover

物品については必要であったものを購入したが、昨今のCOVID-19流行により国内、海外含め学会発表がほとんど中止となりオンライン開催となったため、旅費を計上しなかった。その他、COVID-19の影響により研究活動も一時制限されていた時期があった。次年度も引き続きCOVID-19の流行がおさまる兆しがないため、学会等についてはオンライン開催が予想される。旅費で計上している分については、追加の研究資材に充当する予定である。