2021 Fiscal Year Research-status Report
IKZFファミリーの協調的な転写制御の異常によるリンパ球分化障害の病態解明
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20K16884
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
山下 基 東京医科歯科大学, 東京医科歯科大学病院, 助教 (70869122)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | AIOLOS異常症 / IKZF転写因子ファミリー / 先天性免疫異常症 / IKZF3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
IKZFファミリー転写因子は血球分化を司り、IKZFファミリーに属するIKAROSの生殖細胞系列のバリアントが先天性免疫異常症を起こすことが知られていた。我々はB細胞欠損症の新規原因遺伝子として、IKAROSのホモログであるAIOLOSの生殖細胞系列のミスセンスバリアントを同定した。AIOLOS異常症の分子病態はAIOLOSの機能障害だけでなく、変異AIOLOSはIKAROSとヘテロ二量体を形成することで、IKAROSの機能を障害することによることを細胞株を用いたin vitro解析、患者変異ノックインマウスの解析により示した。今年度、このAIOLOS異常症を疾患マウスモデルの分子病態解析とともに原著論文として発表した。また、AIOLOS異常症や類縁疾患のIKAROS欠損症に関連する総説を執筆した。
今年度は、IKZFファミリー間のヘテロダイマー形成と、相互作用をin vitroで研究するために内在性のAIOLOSとIKAROSをノックアウトしたヒトB細胞株（NALM6）をCRISPR/Cas9技術を用いて作成した。
今後はこのAIOLOS、IKAROSダブルノックアウト細胞を用いて、ペプチドタグ標識したAIOLOS（野生型AIOLOSやAIOLOS異常症に同定されているAIOLOS変異体）やIKAROSをさまざまな組み合わせで遺伝子導入し、それぞれのタンパクに対するChIP-seqやトランスクリプトーム解析を行いDNA結合特異性の変化や転写調節の変化、分子病態の解明を進める。さらに他のAIOLOS異常症の変異ノックインマウスや先天性免疫異常症の原因となる他のIKZFファミリーの変異についてもノックインマウスの作成と免疫学的解析も引き続き検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度は、IKZFファミリー間のヘテロダイマー形成と、相互作用をin vitroで研究するために内在性のAIOLOSとIKAROSをノックアウトしたヒトB細胞株（NALM6）をCRISPR/Cas9技術を用いて作成した。すでに樹立されているAIOLOSノックアウト細胞を用いて、IKAROSにフレームシフトを導入するsingle-guide RNA (sgRNA)を設計し、このsgRNA発現ベクターとCas9発現ベクターを遺伝子導入した。その後単一細胞クローニングを行いAIOLOS、IKAROSダブルノックアウト細胞を得た。IKAROSのウェスタンブロットによりIKAROSの発現欠損を確認した。
このAIOLOS、IKAROSダブルノックアウト細胞に対してペプチドタグ標識した野生型AIOLOS、我々の同定したAIOLOS異常症の原因バリアント、DNA結合を担う4つのzinc finger (ZF)のうち、2番めと3番めのZFを欠失する変異体およびIKAROSをレトロウイルスを用いて遺伝子導入した。現在、遺伝子導入したAIOLOSとIKAROSがヘテロダイマーを形成するかどうか共免疫沈降を行い確認している。
我々の同定したAIOLOS異常症はin vitroの機能解析、in silicoの構造解析、患者AIOLOS変異をノックインした疾患マウスモデルの免疫学的解析、分子病態の解析を行い原著論文として発表した。また、AIOLOS異常症や類縁疾患のIKAROS欠損症に関連する総説を執筆した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度樹立したAIOLOS、IKAROSダブルノックアウト細胞を用いて、ペプチドタグ標識したAIOLOS（野生型AIOLOS、AIOLOS異常症の原因となるAIOLOS変異体）やIKAROSを遺伝子導入し、それぞれのゲノムワイドな結合部位の変化、結合モチーフの変化を検討する。特に異なるAIOLOS変異体によりIKAROSの結合配列や結合部位がどのように変化するのかはAIOLOS異常症の分子病態の解明に寄与する重要な情報と考える。また、異なるAIOLOS変異体や野生型AIOLOSを遺伝子導入したAIOLOS、IKAROSダブルノックアウト細胞のトランスクリプトーム解析を行う。AIOLOS変異体がどのような遺伝子発現を制御するのか、ゲノム上の結合部位の変化とどのように関係するのかについて解析を進める。この実験系は他に報告されているAIOLOS異常症やIKAROS欠損症の疾患原性バリアントを遺伝子導入することでそれぞれのバリアントによる表現型の差異の分子病態を明らかにすることも期待される。
我々の同定したAIOLOS異常症の原因バリアントを再現した疾患マウスモデルでは患者同様のリンパ球分化障害を呈し、Aiolos変異体の二量体化ドメインを欠失させる遺伝子編集によりリンパ球分化障害が改善した。さらに他のAIOLOS異常症の変異ノックインマウスや先天性免疫異常症の原因となる他のIKZFファミリーの変異についてもノックインマウスの作成と免疫学的解析も引き続き検討する。またこれらの疾患マウスモデルに対して、二量体化ドメインを欠失させる遺伝子編集を行うことも検討する。
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| Causes of Carryover |
ChIP-seq解析を次年度に繰り越したため次年度使用額が生じた。
次年度はChIP-seq解析にこれらの費用を充てる予定である。
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[Journal Article] A variant in human AIOLOS impairs adaptive immunity by interfering with IKAROS2021
Author(s)
Yamashita, M., H.S. Kuehn, K. Okuyama, S. Okada, Y. Inoue, N. Mitsuiki, K. Imai, M. Takagi, H. Kanegane, M. Takeuchi, N. Shimojo, M. Tsumura, A.K. Padhi, K.Y.J. Zhang, B. Boisson, J.-L. Casanova, O. Ohara, S.D. Rosenzweig, I. Taniuchi, and T. Morio.
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Journal Title
Nature Immunology
Volume: 22
Pages: 893～903
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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