2020 Fiscal Year Research-status Report
テノホビル(TDF)に対する新規耐性HBVの同定と耐性メカニズムの解明
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20K16996
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
林 佐奈衣 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 特定事業研究員 (10597587)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | B型肝炎ウイルス / 核酸アナログ / テノホビル / 変異 / 耐性 / genotype |
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| Outline of Annual Research Achievements |
B型肝炎ウイルス (HBV)の推奨治療薬である核酸アナログ (NAs) は、HBVのDNA複製を抑制し予後を改善する治療薬だが、NAs耐性HBV株の出現による治療不応が問題視されている。研究代表者は、現在臨床で推奨されるテノホビル(TDF)に対して抵抗性を示す複数のB型慢性肝炎(CHB)症例より新規の変異パターンを検出したが、TDF耐性メカニズムは明らかではない。そこで本研究では1)現在問題とされるTDF治療不応例より新規HBV変異株を分離(同定)し2) TDFの治療効果に関連するHBV変異株のウイルス学的特徴づけおよび、TDFに対する薬剤感受性を評価した。
1)TDFに対して抵抗性を示した代表的なCHB症例の血清よりHBVDNAを抽出し、全長HBVゲノムをクローニングし、1.24倍長の新規HBV発現プラスミドを樹立した。分子系統解析の結果、HBV遺伝子型はgenotype C2/Ce型であった。
2)1)で樹立したTDF不応患者由来の新規HBV発現プラスミドをHuh7細胞へトランスフェクションし、細胞内ウイルス複製量をサザンブロット法、細胞外HBsAg量をCLEIA法により評価した。コントロールとして、当室で樹立した1.24倍長 HBV genotype C2/Ce DNA genome (AB246345) を用いた。その結果、コントロールと比較して新規HBV発現プラスミドでは、細胞内ウイルス複製量は30%程度と少なく、細胞外HBsAg量は160%と高いことが明らかになった。また、サザンブロットを用いて新規HBV発現プラスミドのTDF感受性を比較検討した結果、新規HBV発現プラスミドはコントロールと同等のTDF感受性を示した。今後は、1)で樹立した新規HBV発現プラスミドをバックボーンとして、TDF不応症例で認められた各種の変異を組み込み、TDF感受性評価を実施予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究代表者が全国多施設病院で問題となっている複数のTDF不応のB型慢性肝炎患者に対してダイレクトシーケンス法によりHBV遺伝子解析を行った結果、先日報告されたTDF耐性コンビネーション変異rtS106C/H126Y/D134E/L269Iとは異なる変異パターンのHBV株を同定した。
一方で、この新規HBV株のTDF感受性が不良となる詳細なメカニズムは明らかではなく、これらの情報だけでは他のTDF不応例の原因解明は難しい。
本研究では既に、代表的なTDF耐性患者血清より、バックボーンとなる新規HBV発現プラスミド(genotype C2/Ce)を樹立し、ウイルス学的特徴づけおよび、TDFに対する薬剤感受性評価を実施済みである。以上、研究計画はおおむね順調に進展していると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、TDF治療不応例より新規のTDF耐性変異株を同定することを目的とし、1年目に樹立したTDF耐性患者由来のHBVを発現するプラスミドバックボーンに対して、複数のTDF耐性患者より同定した特徴的なHBV変異をsite-directed mutagenesisにより導入し、複数の変異パターンを有するHBV発現プラスミドの樹立を目指す。これらのHBV発現プラスミドに対してTDF存在下におけるHBV複製効率を検討し、新規HBV株が実際にTDF抵抗性を示すか、また、その他の抗HBV薬に対する感受性を評価する。以上の解析により、TDF不応例のウイルス学的メカニズムが明らかになり、現存治療薬の最適な選択が可能となる。またTDF耐性変異のgenotype依存性について新しい情報が得られると期待される。
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| Causes of Carryover |
(理由)
試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。
(使用計画)
次年度は多種のHBV発現プラスミドを樹立し、トランスフェクション評価系を用いて細胞内外のHBV発現量を解析するため、主にクローニングおよび培養細胞を用いたin vitro実験に必要な各種関連試薬、プラスチック/ガラス製品、サザンブロット関連試薬などの購入のため、物品費を計上する。
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