Na輸送体を効果的に解析可能な腎尿細管3次元培養モデルによる高血圧発症機序の解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17252
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 水口 建 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (30814511)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 腎尿細管スフェロイド / 3次元培養 / Na輸送体 / アミノ酸輸送 / 虚血再灌流障害 / 低酸素

Outline of Annual Research Achievements

これまでの研究でHK-2細胞を3次元培養することによりヒト近位尿細管の実験モデルを確立するという目標を達成することができた。HK-2細胞の3次元培養モデルでは2次元培養モデルと比較してNa輸送能が活性化していること、細胞内の遊離アミノ酸濃度が上昇していることが分かった。過去に実施したRNAシークエンス解析の結果からNa/アミノ酸輸送体であるSLC6A15がその一部を担っているのではないかと考えて、SLC6A15に対してRNA干渉の実験を開始した。しかし、3D培養したHK-2細胞では十分なノックダウン効率を得ることができなかった。一方、2022年度では本実験モデルを他の研究に活かすことはできないかと考えて、虚血再灌流障害モデルとしての使用可能性について検討した。その結果、2Dならびに3D培養したHK-2細胞では、低酸素環境下で培養することによりHIF-1αの発現を免疫蛍光染色やウェスタンブロット法で確認できた。また、通常酸素環境下に戻すことにより細胞死が起きることも確認することができた。興味深いことに3D培養では2D培養と比較して虚血再灌流後の細胞死が少ない傾向が認められ、低酸素ストレスに対する防御機構が新たに存在するのではないかと考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

HK-2細胞は3D培養することで2D培養よりも低酸素ストレスに対して防御機構を再び有するのではないかと考えた。まず酸化ストレス防御機構を具体的に調べるため、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターぜ(SOD)、グルタチオンに着目して各種の酸化ストレスマーカーを測定した。カタラーゼとSODに関しては3D培養で大きな変化を認められなかったが、グルタチオン濃度は3D培養で大きく上昇を認めた。続いて低酸素ストレスによって発生する活性酸素(ROS)を調べるために、HK-2細胞を低酸素培養したのち通常酸素に戻し、ROS-Glo H2O2 assayを用いて測定した。しかし、2D培養群と3D培養群、低酸素群とコントロール群、バックグラウンドいずれにおいても発光シグナルを得ることができなかった。ROS測定のための測定条件を設定することに難渋している。

Strategy for Future Research Activity

3D培養することによりHK-2細胞はグルタチオンという酸化ストレス防御機構を再び有する可能性が考えられた。この点に着目してさらに虚血再灌流障害モデルとして深く調べていきたい。一方で今年度はROS-Glo assayでROSを測定することができなかった。引き続き測定条件を検討するとともに、測定方法や測定対象についても考え直す必要がある。

Causes of Carryover

主に酸化ストレスマーカーを測定する実験を繰り返したため、高度な試薬や機器を購入する必要がなかった。過去に購入した試薬や所属研究室内で保持していた試薬を使うことで実験の遂行が可能であった。