2020 Fiscal Year Research-status Report
ノロウイルス流行予測の基礎データとなるRdRpによるゲノム複製に関する研究
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20K18924
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| Research Institution | Osaka Institute of Public Health |
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Principal Investigator |
白井 達哉 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 微生物部, 研究員 (30846473)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ノロウイルス / RdRp / 遺伝子変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ノロウイルス（NV）の複製に関わるRdRp（RNA-dependent-RNA-polymerase）による変異率を算出し、NV変異株における流行の解明につながる基礎的な研究を行うことを目的としている。NV RdRpには多様な遺伝子型が存在しており、RdRpとCapsidコード領域の間での組換えにより新たな流行株が出現している。そのため、複数のRdRpとCapsid遺伝子型を用いて解析を行う必要がある。具体的には、哺乳類細胞での遺伝子複製時にNV遺伝子全長に対してどういった変異を起こすのか、それを様々な遺伝子型で解析する手法を確立することを目指している。本来のノロウイルスの複製に近い形で再現するために、NV全長を組み込んだベクターを導入し、そこからRdRpを含むすべてのタンパク質を発現させ、複製過程を確認することにした。2020年度は以下の研究を実施した。
（1）NV遺伝子のPCRによる増幅：糞便試料から抽出したRNAに対し、遺伝子全長（約7.5kb）を増幅するPCRを実施した。2020年度までにリアルタイムPCRで陽性となった79検体に対して行い、GIは6検体、GIIは33検体で増幅が確認された。
（2）クローニング：遺伝子全長を増幅した試料のうち、DNA量が十分と思われる14検体についてクローニングを試み、GII.4[P31]、GII.3[P12]、GII.4[P16]及びGII.14[P7]の遺伝子を含む組換え体を作出した。
（3）哺乳類発現ベクターへの遺伝子挿入： In-fusion cloning法により、GII.4[P31]、GII.3[P12]の2つの遺伝子型の遺伝子全長について、哺乳類発現ベクターへの挿入が終了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画調書に照らし合わせると、2020年度、2021年度に鋳型産生用プラスミド構築、発現プラスミド作製としており、2021年度からRNA複製実験を開始するとしている。概ねこの通りに進行していることから、上記の区分とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
クローニングがなされていない遺伝子型について検体が得られたら、PCRによる増幅を引き続き試みる。
作製した哺乳類発現ベクターについては、トランスフェクションにより哺乳類細胞に導入し、NV遺伝子発現をウェスタンブロッティング法などにより確認する。NV遺伝子全長を組み込んだベクターからのRdRp発現が難しい場合は、RdRpのみを発現するベクターを別途導入し、発現させる。RdRpによるRNAの複製が確認できれば、その変異を解析する。
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| Causes of Carryover |
本研究所ではウイルス遺伝子を用いた研究テーマを複数有しており、今年度に実施したPCRやクローニングに関して、試薬や物品の一部を試薬や物品を他の研究と共用するなどして無駄をなくし、コストを抑える工夫ができた。一方で、SARS-CoV2流行により、年度末に購入予定であった消耗品が発注できなかった。また、情報収集のために参加予定であった学会がWeb開催になるなどして、旅費が発生しなかった。
次年度以降の使用計画としては、（1）トランスフェクションやそれに用いるベクター、細胞の検討、（2）たん白質の発現確認に用いる抗体の作製、購入、（3）RNA変異解析のためのシークエンス解析等を充実したものにするために利用する。
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