2018 Fiscal Year Annual Research Report
Establishments of Biothermology which discusses heat and temperature in molecular, cellular and evolutionary sspects
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17H06258
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
亀井 保博 基礎生物学研究所, 生物機能解析センター, 特任准教授 (70372563)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 熱ショック応答 / HSF / 赤外レーザー / イメージング / 温度計測 / 単一細胞 / biothermology / 分子進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の目的は、生物における温度に関わる現象を理解するための理論を考えることである。30年度は、研究計画の初動として、現在までに異生物種HSF1の利用による熱ショック応答温度を変える方法のトランスジェニック動物での実証のための準備として、レシピエントであるメダカHSF1のKOを確立し、約10種の生物種のHSF1のインシリコクローニングを完了し、数種類を実際にクローニングして培養細胞に導入・発現させて、熱ショック応答温度を解析した。応答温度低下が大きすぎると飼育温度も下げる必要が生じるため、30年度には、飼育と応答温度で最良の組み合わせを検討する。また、それぞれのHSF1の3量体形成温度やHSE配列との温度依存的な結合特性解析を、組換えタンパク質で実施する。一方で、温度計測系では、共同研究先の大阪大学と共にgTEMPと名付けた蛍光タンパク質温度プローブを報告しているが、光毒性の少ない長波長域で励起が可能なverを開発し、培養細胞系への導入が完了し、赤外レーザー照射による温度変化を高速で観測できる顕微鏡の構築も完了した。赤外レーザー照射部位の温度計測プローブによる高速温度イメージングが可能となったが、組み換えタンパク質と、培養細胞発現系における温度-蛍光レシオ検量線の一致度が低く、現在その原因探索と改善を検討中である。IR-LEGO顕微鏡法の応用として国際共同研究も実施し、熱ショック応答による遺伝子発現ではなく、単一細胞アブレーションによる神経細胞再生過程の解析に加え、分子同定のための追加実験を実施した。これらの成果は近日投稿予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本課題は2つのカテゴリーを同時並行で進める計画となっており、【A】生体構成要素（オルガネラ・細胞質・生体分子など）の熱的な物理特性の解析と、【B】生体分子（タンパク質、核酸）の熱・温度に対する物性の進化過程における変化の解析を計画している。まず、【A】については、細胞レベルでの熱的物性評価系として、温度計測プローブの開発と、高速温度イメージング顕微鏡の開発の2つが前提条件となる。一昨年度は備品としてW-View Gemini（顕微鏡イメージング用分光装置）を購入し、高速ライトシート顕微鏡（基礎生物学研究所野中准教授の協力）へ導入する予定であったが、赤外レーザー導入光学系の設置が空間的に困難であるため、まずは通常の蛍光顕微鏡による高速温度計測系を構築し、実測まで達成できた。以上から、Aに関しては予定通り進捗しているといえる。【B】に関しては、HSF1をモデルに複数生物種において生息温度と、熱ショック応答温度の評価を、in vivoとin vitroで実施する予定であるが、in vivoの土台となるメダカHSF1-KO系統を樹立（投稿中）し、培養細胞系における評価を実施するまでに至った。今後はin vitro系での複数生物種の組換えタンパク質を行うが、そのベースとなる配列はクローニングを完了し、ベクター構築まで進んでいる。以上からBに関しても順調に進捗していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現状の進捗は予定通り進んでいるため、31年度に特段の変更は考えていない。一方で、当所計画と異なる点としては、別件外部資金が採択となり、一部の研究機器（顕微鏡関連と、分子生物学的な機器類）の購入したため、共通で使用できる装置を予定以上に揃えることができ、今後の計画での実験手技の幅が広がったので、必要に応じて新たな検証実験を加えることを考える。具体的には、高速細胞温度計測顕微鏡のリアルタイム演算のためのPCの購入ができたので当所計画では画像取得後に演算する予定であったが、リアルタイムで表示できるようにする。直接的には研究に直結しない部分であるが、これまでに、バイオサーモロジーワークショップを開催してきたが、31年度にも開催を継続する。共同研究者や、関連分野の研究者と相談して講演者をすでに決定し、開催に向けて準備を進めている。このワークショップを通じて、本研究課題遂行に必要な情報交換や、共同研究を積極的に模索する。
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