2020 Fiscal Year Research-status Report
DNA損傷時のエピゲノム修復における長鎖非翻訳RNAの役割と発がんへの関与
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20K20598
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
近藤 豊 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (00419897)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
飯島 健太 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 研究技術職員 (20565626)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 非翻訳RNA / エピゲノム / DNA損傷 / 相同組換え修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム、およびエピゲノム安定性の維持は細胞の生存や個体の発生において極めて重要であり、その破綻はがん等の疾患の原因となる。特にDNA損傷時にエピゲノム情報が失われたり傷ついたりした際に、どのようにオリジナルのエピゲノム修飾が修復・維持されるのかについては解明が進んでいない。本研究では、DNA損傷時のエピゲノム安定性の維持・調節機構について、長鎖非翻訳RNA（lncRNA）の機能に着目し明らかにすることを目的とする。エピゲノム不安定性は、がん細胞の発生および可塑性の獲得のための分子基盤として重要な要素のひとつであり、その誘導機序を解明することは、がんの生物学的理解のみならず、新たな予防・治療標的を見出す革新的アプローチにつながる。特にDNA損傷によってDNAメチル化情報やヒストンタンパク質の脱離した領域におけるエピゲノム修復機構として、lncRNAを介する機構を提起し、エピゲノム安定性に関して以下の３つのサブテーマの解明を試みる。1) 相同組換え(HR) 修復を起点とするエピゲノム修飾変化の解析、2) 修復部位のlncRNAおよびエピゲノム修飾因子の同定とエピゲノム修復機構の解明、3) エピゲノム安定性低下による発がんへの関与。本年度は、まずDNA損傷部位におけるエピゲノム修飾変化を捕捉するための実験系の確立に着手し、次の①および②について実施した。① 修復部位のlncRNAおよびエピゲノム修飾因子の同定とエピゲノム修復機構の解明、② HR修復後のエピゲノム修飾の解明。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の以下の研究を行い、おおむね順調に進展している。
① 修復部位のlncRNAおよびエピゲノム修飾因子の同定とエピゲノム修復機構の解明：予備実験としてU2OS 2-6-3細胞（LacO反復配列安定導入細胞株）へ、Cas9 nucleaseとLacO配列を標的とするsgRNAを導入し、LacO領域におけるCas9タンパク質の集積、およびDNA損傷誘導を可視化した。LacO標的sgRNAの導入によって、Cas9タンパク質がLacO領域に集積し、DNA二重鎖切断を誘導していることが確認できた。DNA損傷部位におけるエピゲノム修飾、およびDNA損傷部位へ集積するlncRNAを網羅的に解析するために、近接依存性ビオチン標識法の1つであるAPEX（Ascorbate peroxidase）利用する。U2OS 2-6-3細胞に安定的にCas9-APEX融合タンパク質を発現する細胞系を樹立し、DNA損傷により特異的に誘導されるタンパク質、およびRNAのビオチン化を特異的に検出する条件の最適化を進めている。② HR修復後のエピゲノム修飾の解明： dCas9融合ビオチンリガーゼタンパク質（dCas9-BirA）を用いてAvi-tag付加ヒストンH2Bタンパク質（Avi-H2B）を任意のゲノム領域においてビオチン化し、DNA損傷誘導後のビオチン化Avi-H2Bの動態を明らかにする。本年度はAvi-H2Bを安定的に発現するHRレポーター（DR-GFP）組込みU2OS細胞を取得した。またHR修復の損傷鎖と鋳型鎖を特異的に認識するためのsgRNAの機能性について検証した。
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| Strategy for Future Research Activity |
樹立した系を用いて、引き続きDNA損傷後のヒストンタンパク質の動態とエピゲノム修飾について3つのサブテーマを実施し解析を進める。1) HR修復を起点とするエピゲノム修飾変化の解析：遺伝子領域部位特異的に様々な種類のDNA損傷を誘導し、HR修復時のエピゲノム修飾変化について解析を行う。2) 修復部位のlncRNAおよびエピゲノム修飾因子の同定とエピゲノム修復機構の解明：損傷部位のlncRNAおよびエピゲノム修飾因子を同定し、HR修復時のエピゲノム修飾機序についての詳細を明らかにする。3) エピゲノム安定性低下による発がんへの関与：同定したlncRNAやエピゲノム修復関連タンパク質のノックアウトマウスを作成し、表現型の解析を行うとともに、エピゲノム修復機構と発がんとの関連を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
コロナ感染症により試薬の供給に遅れが生じたため、TUG1のm6A修飾RNA領域の同定が令和2年度内に終了できなかった。令和3年度にTUG1のm6A修飾を行い、タンパク質群との相互作用に及ぼす影響を解析する。さらにがん幹細胞を用いてTUG1のm6A修飾RNA領域のA（Adenine）をCRISPR/Cas9システムを利用して取り除き、腫瘍形成能等の細胞に対する影響や、TUG1と結合するタンパク質との相互作用に与える影響について解析する。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] Establishment and characterization of cell lines from human endometrial epithelial and mesenchymal cells from patients with endometriosis.2020
Author(s)
Muraoka A, Osuka S, Kiyono T, Suzuki M, Yokoi A, Murase T, Nishino K, Niimi K, Nakamura T, Goto M, Kajiyama H, Kondo Y, Kikkawa F.
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Journal Title
Fertil Steril Sci.
Volume: 2
Pages: 195-205
Peer Reviewed
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