2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of "Super"Anti-CRISPR molecules
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20K21253
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
野村 渉 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (80463909)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR-Cas / アンチクリスパー / オフターゲット作用 / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集技術ではCRISPR-Cas9などのヌクレアーゼによる標的遺伝子切断によって生じる変異を利用して遺伝子ノックアウトを行う。ゲノム上に存在する標的配列に類似した箇所での「意図しない」切断（オフターゲット作用）が問題視されている 。また、非常に高い利便性のため、バイオテロなどへの悪用も懸念されており、国際的に協調した厳密な規制やブレーキ機構（分子）の開発が求められている。現状では各クリスパーキャスファミリーに個別に対応したアンチクリスパー分子を利用する方法しかないが、すべてのクリスパーキャスファミリーに対して共通に働くアンチクリスパー分子があることで産業利用の加速化が期待できる。そこで本課題では広いスペクトルと高い阻害活性を有するアンチクリスパーを”Super”Anti-CRISPR分子として新たに創製することを目的としている。最も汎用されているSpCas9に対するアンチクリスパーとしてAcrIIA4が存在するが、クリスパーキャスファミリーが由来する微生物・細菌のゲノムを探索することでそれぞれに対応するアンチクリスパー分子が存在する。今年度は、SaCas9の発現系の構築、AcrIIA1～A6の発現系の構築を行った。また、AcrIIA1～A6の発現系を構築し、Site-directed mutagenesisによるライブラリー構築にも着手することができた。また、Cas12a(Cpf1)、NmCas9についても発現系の構築を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度に実施予定であった研究内容についてすべて実施することができた。特にSaCas9についてはAcrIIA1～A6の発現系とともに順調に発現系を構築できており、阻害効果に関する検討も既に開始できていることから次年度に予定している計画も着実に進められると考えている。以上のことからこのように進捗状況を評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
SaCas9に対するAcrIIA1～A6の阻害活性について評価を進めると同時に、阻害活性に重要なアミノ酸残基にsite-directed mutagenesisを行い、変異を導入したライブラリーの構築を進める。高活性な分子を選択するスクリーニング手法にはゲノム編集によって変異が導入されることでEGFPの蛍光消失が誘起されるシステムを採用し、高活性Anti-CRISPR分子を有する細胞を選択的に得る。データベースを活用したニューラルネットワークを利用した配列生成として、広いスペクトルを有するAnti-CRISPR分子については、研究協力者である国立基盤健康栄養研究所 荒木通啓先生に、Anti-CRISPR分子の配列を収蔵するデータベースの配列を全て取り込み、機械学習法・ニューラルネットワークの技術を利用して配列的特徴の抽出に基づくタンパク質配列を取得するという手法によって新たな分子配列を生成し、上記のスクリーニング手法で同様に評価を行う。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額について6,000円余りが生じている。研究の実施計画については予定通り進められているため、翌年度分として請求した助成金と合わせて計画的に使用する。
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[Journal Article] Discovery of a Macropinocytosis‐Inducing Peptide Potentiated by Medium‐Mediated Intramolecular Disulfide Formation2021
Author(s)
Jan Vincent V. Arafiles, Hisaaki Hirose, Yusuke Hirai, Masashi Kuriyama, Maxwell M. Sakyiamah, Wataru Nomura, Kazuhiro Sonomura, Miki Imanishi, Akira Otaka, Hirokazu Tamamura, Shiroh Futaki
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Journal Title
Angewandte Chemie, International Edition
Volume: 60
Pages: 2-11
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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