2020 Fiscal Year Research-status Report
Rapid and specific diagnosis for tumor using exosome and cfDNA
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20K21375
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
三浦 直樹 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (80508036)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 雅 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (40750419)
古澤 悠 鹿児島大学, 共同獣医学部, 特任助教 (30791793)
畑井 仁 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (40566535)
川原 幸一 大阪工業大学, 工学部, 教授 (10381170)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| Keywords | エクソソーム / 犬 / 腫瘍 / non-coding RNA / cfDNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，犬の腫瘍特異的マイクロRNAを含有するエクソソームと犬腫瘍特異的変位を含む血中のcell-free DNA(cfDNA)の検出と臨床応用法に挑戦するものである．
１）腫瘍特異的エクソソーム解析では，エクソソーム表面の腫瘍特異的糖鎖の同定として，レクチンアレイで選別したエクソソーム表面の糖鎖を確認した．具体的には，犬メラノ―マ，犬肝細胞癌，犬の乳腺腫瘍の培養細胞と腫瘍罹患犬と非罹患犬の血中のエクソソームを分離して，レクチンアレイ解析を実施した．その結果，腫瘍と非腫瘍のエクソソーム間や各細胞株間で発現の違いが見られた．
２）犬の腫瘍関連エクソソームの単離法を確認し確立した．超遠心法とスピンカラムによる方法を比較し，単離後のエクソソームはWB解析や含有マイクロRNAをリアルタイムPCRなどで評価した．さらに，腫瘍関連エクソソーム含有マイクロRNAの同定と生物活性の確認として，犬メラノーマ細胞株が分泌するエクソソーム中のマイクロRNAをNGSでスクリーニングし，標的マイクロRNAを確認した（結果は第136回日本獣医学会，第5回AJIVEで発表し，現在，論文がリバイス中である）．
３）腫瘍特異的cfDNA解析では，血液循環cfDNAの腫瘍特異的SNPsの同定と測定法の確立として，細胞株などの発現遺伝子のNGSで解析し，犬メラノーマ細胞株に共通した変異を確認した．ターゲットのSNPsに対するデジタルPCRとリアルタイムPCRで使用可能なプライマー＆プローブセットを独自にデザインした．
４）Liquid biopsyの実証試験としてエクソソームとcfDNAの臨床サンプルでの調査のために，大学の症例のみならず，全国７カ所の開業動物病院（大学院生が院長）でのサンプリングを開始した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エクソソームの分離や表面マーカー候補の解析が終了し，内在するマイクロRNAのターゲット候補を選出できている．臨床的サンプルでの予備検討も少数例で行えている，成果は国際学会を含む学会で発表し，論文も既に投稿済みであることから，順調に進行していると判断できる．
cfDNAの解析は，最初のターゲットのSNPsを決定し解析を進められている．まだ，複数の細胞株などでの解析が十分でないことから，臨床例での解析が行えていないが、おおむね順調に進められていると判断している．
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| Strategy for Future Research Activity |
レクチンアレイで選別したエクソソーム表面の糖鎖の結果、腫瘍と非腫瘍のエクソソーム間や各細胞株間で発現の違いが見られたが、All or Nothingではなく、発現強度の差が見られている段階であり、より詳細な特異性の解析が必要と考えられ，今後継続して，より特異的な標的を決定する．
エクソソーム中のRNA分子にはマイクロRNA以外のnon-coding RNAが含まれていることが次世代シーケンス解析で確認できている．今後はさらに腫瘍に特異的なRNA分子候補として，これらの非マイクロRNAnon-coding small RNA分子の発現変化も解析する（実際に過去の科研費の成果として牛の乳房炎でsnRNA分子が変化することを報告している）．
cfDNA解析では，ターゲット候補SNPsに関して，犬の腫瘍細胞株（メラノーマ3種、肝細胞癌3種、乳腺腫瘍3種、リンパ腫、骨肉腫など）での特異性・共通性を確認する．さらに，血液に既知のcfDNAを添加して，検出限界などをデジタルPCRとりらるタイムPCRで比較検討する．
エクソソームとcfDNA解析で得られたマーカー候補に関して，実臨床サンプルでの有用性を評価する．
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| Causes of Carryover |
研究はおおむね順調に進んでおり、ターゲットを決定しているが、そのターゲットの解析が未完成であり、リアルタイムPCRやデジタルPCRの消耗品経費が未使用で繰り越している。2年目はそれらを一気に測定する計画である。また、臨床サンプルでの解析がサンプルをストックしている状態であり、こちらも2年目に測定予定である。
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