健康長寿の向上を企図したバイオミメティクDDSの創製とサルコペニア治療への応用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21485
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 丸山 徹 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (90423657)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡邊 博志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (70398220) ; 前田 仁志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (80791483)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2022-03-31
• Keywords: サルコペニア / 筋萎縮因子 / バイオミメティック / アルブミン融合技術 / チオレドキシン / グレリン / sActRIIB

Outline of Annual Research Achievements

サルコペニアを呈すると、医療・介護といった社会保障コストが増加することから、増え続ける社会保障費を抑制するためには、本疾患に対する緊急かつ抜本的な対策が求められている。サルコペニア治療薬として”筋萎縮阻害因”が有望視されているものの、未だ実用化には至っていない。本研究では、冬眠中の熊は長期臥位であっても筋萎縮や筋力低下を生じない点に着目し、熊の冬眠に備わった筋萎縮阻害因子の持続的な筋組織供給による抗サルコペニア機構を模倣したバイオミメティックな薬物送達システム(DDS）の開発を試みる。筋萎縮阻害因子としては、冬眠中に増加し、筋保護/修復効果に優れる① チオレドキシン、② 筋萎縮因子ミオスタチンの阻害剤であるsActRⅡB、③ グレリンの3種類を選択する。だだし、これらの筋萎縮阻害因子を投与しても、血中滞溜性が乏しく、筋組織への移行性にも優れていないため、冬眠中に観察される損傷筋肉部位への効率的かつ持続的な供給システムを模倣することはできない。本研究では、上述した臨床応用における課題を克服する手段として、血中滞溜性に富み、筋組織への移行性も高い上、安定かつ生体適合性に優れたヒト血清アルブミン(HSA)ダイマーに、血管拡張作用による血流改善及び筋組織内圧低下により損傷筋肉部位へのHSA移行性を亢進する一酸化窒素(NO)を搭載したS-ニトロソ化HSAダイマー(SNO-HSAダイマー)をDDS担体として用い、申請者が確立したアルブミン融合技術を駆使して、上述した筋萎縮阻害因子とSNO-HSAダイマーを遺伝子レベルで接合した遺伝子組換え型融合体(SNO-HSAダイマー-筋萎縮阻害因子融合体)を設計する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

HSAダイマーのcDNAを組み込んだ発現ベクター(pPIC9)に、(ⅰ)チオレドキシン、(ⅱ)sActRⅡB、(ⅲ)グレリンのcDNAを挿入し、3種類のHSAダイマー-筋萎縮阻害因子融合体のpDNAを作製した。さらに、チオレドキシンとグレリンの2種類をHSAダイマーのN末とC末の両端に接合した二重ヘテロ融合体(計3種類)を作製した。ここで、グレリンとHSAダイマーの間には2種類のペプチドリンカー(非切断型(-(GGGGS)2-)、②解離型(-GGGSC-CSGGG-))を挿入した。次に、作製した各種pDNAを酵母に遺伝子導入・形質転換を行い、培養後、各種クロマト法により精製した。この精製したHSAダイマー-筋萎縮阻害因子融合体にイソアミル亜硝酸を添加することで、S-ニトロソ化体を調製した。HPLCによる定量の結果、NO抱合率は１分子当たり0.7個であり、通常1分子のHSAに負荷できるNO抱合率が0.4であることを考えると、妥当な結果であると判断された。作製したSNO-HSAダイマー・筋萎縮阻害因子融合体の立体構造を、各種スペクトル法(蛍光、円二色性)及び免疫学的手法で解析したところ、HSAが有する特徴を保持していたことから、融合化による立体的な影響は少ないと判断した。さらに。融合化が筋萎縮阻害因子の生物活性に及ぼす影響を、筋線維芽細胞(C2C12)を用い検討した。ここで、筋萎縮因子の誘導には以前我々が見出した、筋萎縮を誘導する尿毒症物質インドキシル硫酸(IS)を用いた。その結果、ISにより上昇した筋萎縮因子Atrogin-1ならびにMyostatinは全てのSNO化融合体で減少した。その中でも解離型のチオレドキシン・グレリン二重ヘテロSNO化融合体が最も効果が高かったことから、次年度はこの融合体の体内動態及び筋萎縮モデルマウスを用いた検討を実施する。

Strategy for Future Research Activity

12種類のSNO-HSAダイマー融合体を、111Inあるいは125Iで放射標識する。次いで、それらを健常ラット及び尾懸垂法で作製した廃用性筋萎縮モデルラットに静脈内投与し、血中及び臓器中の放射活性を経時的にモニタリングしてSNO-HSAダイマー融合体の体内動態(血中滞留性、臓器分布(特に、筋肉、肝臓、腎臓))を解析する。得られた結果を総合的に解釈し、SNO-HSAダイマー-筋萎縮阻害因子融合体の臓器移行性を評価する。
一次性筋萎縮モデルとして、① 坐骨神経切除マウス、② 老化促進(SAMP)マウス(Haramizu S, J GerontolA Biol Sci Med Sci (2011))と③廃用性筋萎縮モデルラットの3種類を二次性筋萎縮モデルとして、申請者が確立した慢性腎不全誘発筋萎縮マウス(5/6腎摘慢性腎不全マウスへ4週間に渡り尿毒症物質インドキシル硫酸を腹腔内投与して作成(Sci Rep (2016))を使用する。これらの病態モデル動物に対して、筋萎縮因子の増加が認められた時点、あるいは筋萎縮が生じ始めた時点から、各種SNO-HSAダイマー-筋萎縮阻害因子融合体を週1回投与して筋萎縮抑制効果を解析する。治療効果は、以下の評価項目(①身体所見(体重、骨格筋重量(ひ腹筋、足底筋、大腿四頭筋、ヒラメ筋)、副睾丸周囲脂肪量)、②病理学的所見(筋障害、速筋/遅筋移行性)、③筋力・筋持久力(小動物用ドレッドミルによる走行試験と小動物握力メータによる握力試験)の測定結果と、病態形成因子;と考えられている血中及び筋肉中の筋萎縮因子・マイオカイン(ミオスタチン、アトロギン、IL-6、IGF-1)産生量(ELISA, Western Blot)、酸化ストレス及び炎症マーカー、ミトコンドリア及びユビキチンリガーゼ活性の変動やオートファジー経路の関与の有無を総合的に解析して判定する。

Research Products

• [Journal Article] Cysteinylated albumin as a potential biomarker for the progression of kidney disease in patients with type 2 diabetes (2021)
  • Author(s): Imafuku T, Watanabe H, Oniki K, Yoshida A, Kato H, Nakano T, Tokumaru K, Fujita I, Arimura N, Maeda H, Sakamoto Y, Kondo N, Morita A, Saruwatari J, Tanaka M, Matsushita K, Wada T, Fukagawa M, Otagiri M, Fitzgerald ML, Jinnouchi H, Maruyama T.
  • Journal Title: Diabetes Care Volume: 26 Pages: dc203003.
  • DOI: 10.2337/dc20-3003.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An acute phase protein alfa1-acid glycoprotein mitigates AKI and its progression to CKD through its anti-inflammatory action (2021)
  • Author(s): Hiroshi Watanabe*,#, Rui Fujimura*, Yuto Hiramoto*, Ryota Murata, Kento Nishida, Jing Bi, Tadashi Imafuku, Hisakazu Komori, Hitoshi Maeda, Ayumi Mukunoki, Toru Takeo, Naomi Nakagata, Motoko Tanaka, Kazutaka Matsushita, Masafumi Fukagawa, Toru Maruyama# *equal contribution; #equal correspondence
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 12;11(1) Pages: 7953
  • DOI: 10.1038/s41598-021-87217-8.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Evaluation of a new measurement method of indoxyl sulfate in hemodialysis patients (2021)
  • Author(s): Miwa Goto, Kazuo Azuma, Hidetoshi Arima, Shinichiro Kaneko, Taishi Higashi, Keiichi Motoyama, Akihiro Michihara, Takae Shimizu, Daisuke Kadowaki, Toru Maruyama, Masaki Otagiri, Daisuke Iohara, Fumitoshi Hirayama, Makoto Anraku
  • Journal Title: Ther Apher Dial Volume: 25(1) Pages: 44-49.
  • DOI: 10.1016/j.lfs.2020.118991.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Sacran, a sulfated polysaccharide, suppresses the absorption of lipids and modulates the intestinal flora in non-alcoholic steatohepatitis model rats (2021)
  • Author(s): Miwa Goto, Kazuo Azuma, Hidetoshi Arima, Shinichiro Kaneko, Taishi Higashi, Keiichi Motoyama, Akihiro Michihara, Takae Shimizu, Daisuke Kadowaki, Toru Maruyama, Masaki Otagiri, Daisuke Iohara, Fumitoshi Hirayama, Makoto Anraku
  • Journal Title: Life Sci Volume: 1;268 Pages: 44-49.
  • DOI: 10.1016/j.lfs.2020.118991.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Reduction-responsive and multi-drug deliverable albumin nanoparticles: an antitumor drug to Abraxane_ against human pancreatic tumor-bearing mice (2021)
  • Author(s): Naoki Hirakawa, Yu Ishima, Ryo Kinoshita, Ryuto Nakano, Victor Tuan Giam Chuang, Hidenori Ando, Taro Shimizu, Keiichiro Okuhira, Toru Maruyama, Masaki Otagiri, Tatsuhiro Ishida
  • Journal Title: ACS Applied Bio Materials Volume: 268 Pages: 4302_4309
  • DOI: 10.1021/acsabm.1c00110
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Effect of cinacalcet on the redox status of albumin in secondary hyperparathyroidism patients receiving hemodialysis (2020)
  • Author(s): Tadashi Imafuku, Motoko Tanaka, Koki Tokunaga, Shigeyuki Miyamura, Hiromasa Kato, Shoma Tanaka, Takehiro Nakano, Kenshiro Hirata, Daisuke Kadowaki, Hitoshi Maeda, Kazutaka Matsushita, Masaki Otagiri, Hirotaka Komaba, Masafumi Fukagawa, Hiroshi Watanabe, Toru Maruyama
  • Journal Title: Biol Pharm Bull Volume: 43(10): Pages: 1583-1590.
  • DOI: 10.1248/bpb.b20-00472.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Effects of uremic toxins on the binding of aripiprazole to human serum albumin (2020)
  • Author(s): Koji Nishi, Keiki Sakurama, Hiroshi Watanabe, Toru Maruyama, Keishi Yamasaki, Masaki Otagiri
  • Journal Title: Biol Pharm Bull Volume: 44(3) Pages: 437-441.
  • DOI: 10.1248/bpb.b20-00929.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Effects of surface-deacetylated chitin nanofibers on non-alcoholic steatohepatitis model rats and their gut microbiota (2020)
  • Author(s): Miwa Goto, Daisuke Iohara, Akihiro Michihara, Shinsuke Ifuku, Kazuo Azuma, Daisuke Kadowaki, Toru Maruyama, Masaki Otagiri, Fumitoshi Hirayama, Makoto Anraku
  • Journal Title: Int J Biol Macromol Volume: 1;164: Pages: 659-666.
  • DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.07.184.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Drug delivery system for refractory cancer therapy via an endogenous albumin transport system (2020)
  • Author(s): Yu Ishima, Toru Maruyama, Masaki Otagiri, Tatsuhiro Ishida
  • Journal Title: Chem Pharm Bull (Tokyo) Volume: 68(7): Pages: 583-588.
  • DOI: 10.1248/cpb.c20-00026.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Systemic and sustained thioredoxin analogue prevents acute kidney injury and its-associated distant organ damage in renal ischemia reperfusion injury mice (2020)
  • Author(s): Kento Nishida*, Hiroshi Watanabe*,#, Masako Miyahisa, Yuto Hiramoto, Hiroto Nosaki, Rui Fujimura, Hitoshi Maeda, Masaki Otagiri, Toru Maruyama# *equal contribution; #equal correspondence
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 26;10(1): Pages: 20635.
  • DOI: 10.1038/s41598-020-75025-5.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The late-stage protective effect of Mito-TEMPO against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mouse and three-dimensional cell culture models (2020)
  • Author(s): Mohammad Abdullah-Al-Shoeb, Kenta Sasaki, Saori Kikutani, Nanami Namba, Keiichi Ueno, Yuki Kondo, Hitoshi Maeda, Toru Maruyama, Tetsumi Irie, Yoichi Ishitsuka
  • Journal Title: Antioxidants (Basel) Volume: 9;9(10): Pages: 965.
  • DOI: 10.3390/antiox9100965.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization of the Interaction of Daptomycin With Site II on Human Serum Albumin (2020)
  • Author(s): Keishi Yamasaki, Keiki Sakurama, Koji Nishi, Hiroshi Watanabe, Toru Maruyama, Hakaru Seo, Masaki Otagiri, Kazuaki Taguchi
  • Journal Title: J Pharm Sci Volume: 109(9): Pages: 2919-2924.
  • DOI: 10.1016/j.xphs.2020.06.011.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Indoxyl sulfate contributes to adipose tissue inflammation through the activation of NADPH oxidase (2020)
  • Author(s): Shoma Tanaka*, Hiroshi Watanabe*,#, Takehiro Nakano, Tadashi Imafuku, Hiromasa Kato, Kai Tokumaru, Nanaka Arimura, Yuki Enoki, Hitoshi Maeda, Motoko Tanaka, Kazutaka Matsushita, Masafumi Fukagawa, Toru Maruyama# *equal contribution; #equal correspondence
  • Journal Title: Toxins (Basel) Volume: 5;12(8): Pages: 502.
  • DOI: 10.3390/toxins12080502.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of a long acting FGF21 analogue-albumin fusion protein and its anti-diabetic effects (2020)
  • Author(s): Hiroshi Watanabe*,#, Masako Miyahisa*, Mayuko Chikamatsu*, Kento Nishida, Yuki Minayoshi, Mei Takano, Shota Ichimizu, Yoshihiro Kobashigawa, Hiroshi Morioka, Hitoshi Maeda, Toru Maruyama# *equal contribution; #equal correspondence
  • Journal Title: J Control Release Volume: 10;324: Pages: 522-531.
  • DOI: 10.1016/j.jconrel.2020.05.036.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A synthetic retinoic acid receptor agonist Am80 ameliorates renal fibrosis via inducing the production of alpha-1-acid glycoprotein (2020)
  • Author(s): Hiroshi Watanabe*,#, Jing Bi *, Ryota Murata *, Rui Fujimura , Kento Nishida, Tadashi Imafuku, Yuka Nakamura, Hitoshi Maeda, Ayumi Mukunoki, Toru Takeo, Naomi Nakagata , Yuki Kurauchi, Hiroshi Katsuki , Motoko Tanaka, Kazutaka Matsushita , Masafumi Fukagawa, Toru Maruyama# *equal contribution; #equal correspondence
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 10 Pages: 11424
  • DOI: 10.1038/s41598-020-68337-z.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Advanced oxidation protein products contribute to renal tubulopathy via perturbation of renal fatty acids (2020)
  • Author(s): Imafuku T, Watanabe H, Satoh T, Matsuzaka T, Inazumi T, Kato H, Tanaka S, Nakamura Y, Nakano T, Tokumaru K, Maeda H, Mukunoki A, Takeo T, Nakagata N, Tanaka M, Matsushita K, Tsuchiya S, Sugimoto Y, Shimano H, Fukagawa M, Maruyama T.
  • Journal Title: Kidney360 Volume: 1(8) Pages: 781-796
  • DOI: 10.34067/KID.0000772019
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Changes in redox state of albumin before and after kidney transplantation in patients with end-stage renal disease (2020)
  • Author(s): Ryota Tanaka, Tadashi Imafuku, Yosuke Suzuki, Kento Nishida, Kotaro Matsusaka, Toshitaka Shin, Yuhki Sato, Yu Ishima, Hiroshi Watanabe, Hiromitsu Mimata, Toru Maruyama, Hiroki Itoh
  • Journal Title: Clin Biochem Volume: 81 Pages: 20-26.
  • DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2020.04.010.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vivo evaluation of drug dialyzability in a rat model of hemodialysis (2020)
  • Author(s): Masaki Fukunaga, Daisuke Kadowaki, Mika Mori, Satomi Hagiwara, Yuki Narita, Junji Saruwatari, Ryota Tanaka, Hiroshi Watanabe, Keishi Yamasaki, Kazuaki Taguchi, Hiroki Ito, Toru Maruyama, Masaki Otagiri, Sumio Hirata
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12;15(6) Pages: e0233925.
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0233925.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The DsbA-L gene is associated with respiratory function of the elderly via its adiponectin multimeric or antioxidant properties (2020)
  • Author(s): Kentaro Oniki, Hirofumi Nohara, Ryunosuke Nakashima, Yui Obata, Narumi Muto, Yuki Sakamoto, Keiko Ueno-Shuto, Tadashi Imafuku, Yu Ishima 5 , Hiroshi Watanabe, Toru Maruyama, Koji Otake, Yasuhiro Ogata, Mary Ann Suico, Hirofumi Kai, Tsuyoshi Shuto, Junji Saruwatari
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 6;10(1) Pages: 5973.
  • DOI: 10.1038/s41598-020-62872-5.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] alfa1-acid glycoprotein attenuates adriamycin-induced nephropathy via CD163 expressing macrophages induction. (2020)
  • Author(s): Rui Fujimura*, Hiroshi Watanabe*,#, Kento Nishida, Yukio Fujiwara, Tomoaki Koga T, Jing Bi, Tadashi Imafuku, Kazuki Kobayashi, Hisakazu Komori, Masako Miyahisa, Hitoshi Maeda, Motoko Tanaka, Kazutaka Matsushita, Takashi Wada, Masafumi Fukagawa, Toru Maruyama T# *equal contribution and #equal corresponding author
  • Journal Title: Kidney360 Volume: 1(5) Pages: 343-353
  • DOI: 10.34067/KID.0000782019
  • Peer Reviewed / Open Access