2021 Fiscal Year Research-status Report
ミクログリア由来新規ガイダンス因子による神経回路形成機構の解明と関連病態の解析
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20K21499
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
山岸 覚 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (40372362)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 脳梁 / 軸索ガイダンス分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脳梁はヒトの脳における最大の交連繊維であり、左右の大脳半球を繋ぎ、感覚や言語における情報交換を行っている。発生過程における脳梁形成は、妊娠後期において、大脳皮質神経細胞が皮質板表層へと移動した後に行われる。脳梁が正中交叉を行う際には、正中部に発現している誘引因子であるネトリンに向かって軸索伸長する（Serafini et al., Cell, 1996)。申請者は偶然にも、Csf1r-iCreによってミクログリア特異的に骨形成因子（BMP)阻害分子であるNogginを欠損させると脳梁欠損が見られ、ネトリンノックアウトマウスと同様のフェノタイプが生じることを見出した。
また、Nestin-Creを用いてNogginを欠損させるコンディショナルノックアウトマウスは胎生致死になることが大多数であるが、生後も得られることがあり、これの半数近くは脳梁欠損フェノタイプが見られた。これはCsf1r-iCreよりも高頻度で見られる。また、実際、Nogginプロモーター下でGFPを発現するNoggin-GFPを用いて発現を観察すると、脳梁形成期の大脳皮質神経細胞で強く発現していることが確認された。
Nogginはおそらく分泌因子であると考えられ、これに結合する因子の探索を実施した。質量分析を用いたショットガン解析により、候補となる遺伝子5つ得ることができた。現在はこれらの因子に注目して、培養細胞を刺激した際にNogginと共局在するかということ、それぞれ中和抗体を用いることによりNogginによるシグナル伝達経路が阻害されるかを解析しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在は、脳梁欠損が高い確率で得られるNestin-Cre;Nogginlx/lxマウスを用いて重点的に解析を実施している。ゴルジ染色を用いて多くの神経突起を可視化し、脳梁以外にも神経投射不全が生じていないかを解析しているところである。
また、Noggin-GFPマウスを用いることにより、Nogginの発現パターンが明確となった。この結果をもとに特定の神経細胞に注目して機能解析を実施した結果、新たな神経細胞に対する作用も見出すことができた。
さらには、上述したように、質量分析プロテオミクスを用いて、Nogginに結合すると考えられる因子（受容体の候補）を5つ同定することができた。方法としては、ラットの脳から超遠心によりシナプトソーム分画を集め、Noggin-Fcと結合する因子をProtein Gを用いることによって精製し、LC-MS/MS質量分析を実施した。3回同様の実験を実施したが、毎回の解析で100種類以上の結合因子を得た（対照群としてはcontrol human Fcを用いた）。この中から3回の実験による再現性と、膜貫通型タンパク質であることにより、5つの候補遺伝子に絞ることができた。
また、培養細胞を用いてNogginを刺激し、これら5つの候補遺伝子に対する抗体で免疫染色を実施した結果、これらはそれぞれが単独で受容体として機能しているわけではなく、一部ずつ重なるということを見出した。すなわち、複数の遺伝子が結合因子としてNogginの作用をもたらすのにcontributionしているのではないかと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初予定していた結合因子のノックアウトマウスの作成は、Nogginの結合因子が明確な単独因子として見出した場合には大変効果的であるが、今回、複数の結合因子が明らかとなったため、方針を転換する必要が生じた。本年度の方針としては、見出した因子に関して、ノックアウト・ノックダウンして脳梁神経軸索誘導に異常が生じるかを解析する。また、Nogginによる細胞への効果として、リン酸化カスケードに注目したシグナル伝達系路の解析を検討する。具体的にはNogginで細胞を刺激した後、抗リン酸化抗体で免疫沈降し、R3年度で実施したようにProtein-Gカラムを用いて精製し、質量分析を用いて網羅的に同定する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍により、出張することがなくなり、旅費の出費がなくなった。また、実験補助員の労働が密にならないよう制限したもらったため、人件費・謝金の支出が減少した。
一方、外部資金を獲得することができ、本プロジェクトと共通している試薬（蛍光２次抗体など）を購入する必要性がなくなったため。
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