Elucidation of genomic abnormalities in normal esophageal epithelium associated with radiation therapy and chemotherapy

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21574
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 横山 顕礼 京都大学, 医学研究科, 助教 (20515514)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: 食道扁平上皮 / 2次性発がん / 網羅的ゲノム解析 / 放射線療法 / 化学療法

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、放射線療法（RT）、または、化学療法に伴う正常食道上皮に生じるゲノム異常を解明するために、治療介入後に、食道上皮が再生して治癒してゆく初期の粘膜修復の過程で、どのようなゲノム異常が蓄積するのかを解明することを目的とする。がんサバイバーにとって、がんが治癒しても、化学療法やRTが主な原因とされる2次性がんは、生命の脅威であるが、そのゲノム異常の機序は解明されていない。本研究では、経時的に、内視鏡下にRT範囲内・外の正常食道上皮から内視生検を行い、サンプルを採取して、ゲノム解析を行った。今までに、１例のRT照射から10年以上経過後にRT照射内に発がんを来した飲酒・喫煙歴のないRTの2次発がん典型例からRT照射内のがん部、照射内の正常部、そして、照射外の正常部からマルチサンプル採取を行い、全エクソン解析を行った。その結果、がん部からの3カ所の生検の結果は、通常のがんと同様に、TP53変異を含む共通変異を認めた。これに対して、RT照射外の正常部では、既報と同様にNOTCH1変異を主体としたドライバー変異を認めたが共通変異は認めなかった。一方で、RT照射内の正常部は、ドライバー変異を全く認めないにもかかわらず、すべての部位で共通する変異を認めた。さらに、１個の生検から1mm間隔で格子状に16カ所のマルチサンプルを採取し、全エクソン解析を行った。その結果、全てのサンプルで、ドライバー変異を伴わない共通変異を認めた。以上から、この1例からは、RT後の食道粘膜では、食道におけるドライバー変異が排除されるにもかかわらず、大きなサイズのクローンに置換される可能性が示唆された。このため、治療後１年以内の症例で、短期間でのRT照射による再現性の検証を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

1例の典型例から示されたRT後の食道粘膜では、食道におけるドライバー変異が排除されるにもかかわらず、大きなサイズのクローンに置換される可能性を検証するため、RT照射後１年以内の症例で、経時的なサンプルでの検証を行った。治療前検体のある２例と治療前検体のない２例で検証するも、ドライバー変異が消失する変化は、半数の2/4で再現性があったのみであった。このため、短期では、クローン選択が生じるのに十分な期間ではないと判断し、RT照射後5年以上経過した症例にて、検証を行うこととした。この点を明らかにするために、RT照射内の異時性多発がんの中で、5年以上経過した1例において、切除標本の周囲の正常部4か所から0.5mmのパンチでサンプル採取し、全エクソン解析を行ったが、4サンプルともに、ドライバー変異を認めたため、再現性を確認できなかった。さらに、単一細胞培養を行う予定であったが、生検1個からの初代培養に難渋しており、こちらも細胞分離過程の条件検討を行い、1個から安定した細胞培養が可能になるようにプロトコール改定を行っているが、実際には安定した培養ができていない状況である。

Strategy for Future Research Activity

RT照射から1年以内の比較的短期間での経過観察では、4例中2例でしか再現データが取れなかった。このため、治療前の検体の有無にかかわらず、RT照射後5年の症例において、1例追加解析を行ったが、この1例では再現性が取れなかった。このため、さらに長期の経過を経た症例で、メルクマールがある症例では、周囲からのサンプリング、または、内視鏡切除例があれば、切除標本の周囲正常部からマルチサンプリングすることで、データの再現を取る予定である。また、本研究では、単一細胞培養を行う予定であるが、生検1個からの初代培養に難渋しており、こちらも細胞分離過程の条件検討を行い、1個から安定した細胞培養が可能になるように更なるプロトコール改定を行う予定である。