シングルセルエピゲノム解析を用いた膵β細胞増殖制御機序の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21616
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 稲垣 暢也 京都大学, 医学研究科, 教授 (30241954)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 臼井 亮太 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (40850996) ; 龍岡 久登 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (70850981)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2022-03-31
• Keywords: 膵β細胞 / 増殖 / インスリン / 老化

Outline of Annual Research Achievements

糖尿病は進行性の膵β細胞の機能不全および膵β細胞量の低下を病因としている。膵β細胞機能不全についてはこれまで多種の治療薬が開発されている一方で、膵β細胞量を標的にした治療法は確立されていない。そこで、本研究では膵β細胞増殖の分子基盤解明に着目し、膵β細胞増殖制御に関わる遺伝子ネットワークを同定することを目的とした。
研究手法としては、若齢（8週齢）及び高齢（1年齢）のC57BL/6マウスを用いて、膵β細胞増殖を促す膵部分切除（PPTx）を行った。術後2日で膵島を単離し、膵島全体からRNAを抽出して行うRNAシークエンシング(RNA-seq)および、膵島単離後にトリプシン処理を行って単細胞化した後にRNA抽出を行うシングルセルRNAシークエンシング(scRNA-seq)を行い解析した。
RNA-seqの結果では、PPTxにより若齢マウスでは693の発現上昇遺伝子および573の発現低下遺伝子を認めた一方で、高齢マウスでは52の発現上昇遺伝子と31の発現低下遺伝子を認めた。これらの発現変動遺伝子をGene Ontology解析にて生物学的機能で分類すると、若齢マウスでは細胞周期や有糸分裂等に関連した遺伝子群の発現が亢進していたのに対し、高齢マウスでは炎症反応や免疫反応に関連した遺伝子群が上昇していた。この結果から、PPTxにより若齢マウスで膵β細胞増殖が活発になっていることが示唆された。
scRNA-seqでは、1623細胞の遺伝子プロファイルを検出し、遺伝子発現パターンからクラスタリング行ったところ、6つの細胞亜集団（クラスター）が観察された。
また、術後2日目の単離膵島に対してATAC-seqによるオープンクロマチン領域の検索を行い、若齢、高齢マウスそれぞれでPPTx群に特異的なオープンクロマチン領域の同定を行なった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

scRNA-seqで同定された６つのクラスターの中で4つのクラスターが膵β細胞の集団であり、さらにその中で1つのクラスターで細胞増殖に関わる遺伝子の発現が亢進していることから、このクラスターが増殖膵β細胞の集団であることが示唆された。また、この膵β細胞と考えられる4つのクラスターに対して、膵β細胞増殖の遺伝子ネットワークの最上流で遺伝子発現を制御する鍵分子を同定する目的で疑似時系列解析を行ったところ、疑似時間軸に沿って、E2fファミリー遺伝子の発現上昇が認められた。E2Fファミリーのなかでもβ細胞増殖に関与するという報告のあるE2F1(Diabetes 59. (2010): 1435-1444)の発現がPPTx術後の若齢マウスにて上昇していたことから、PPTxにおける膵β細胞増殖におけるE2F1の役割を明らかにするため、E2F1の全身ノックアウトマウス(E2f1-/-)を既に入手している。また、やはり疑似時系列解析により、小胞体ストレスに関連する遺伝子の発現も、増殖の時系列に従って変化していることが明らかになった。
術後2日目の単離膵島に対して行ったATAC-seqにでは、若年PPTx群では9225の、高齢PPTx群では4142の領域を特異的なオープンクロマチン領域として同定した。
以上のことから、研究計画としてはおおむね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

PPTxによる膵β細胞増殖におけるE2F1の役割を検討するため、E2f1-/-マウスにPPTxを施行し、膵β細胞増殖を免疫組織学的に評価することを計画している。また、膵β細胞増殖をリアルタイムにイメージング可能な、膵β細胞特異的Fucci2a発現マウス、および組織透明化技術による三次元的な膵島内細胞の免疫組織学的評価の系もすでに確立しているので、これらを用いての評価を行うことを計画している。
E2f1以外のE2fファミリー遺伝子と膵β細胞増殖の関係、また小胞体ストレス遺伝子と膵β細胞増殖の関係についても、さらに詳細に検討を加えていくことを計画している。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Geneva Medical School(スイス)
  • Country Name: SWITZERLAND
  • Counterpart Institution: University of Geneva Medical School
• [Int'l Joint Research] CHU d'Angers(フランス)
  • Country Name: FRANCE
  • Counterpart Institution: CHU d'Angers
• [Int'l Joint Research] University of Ulster(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: University of Ulster
• [Int'l Joint Research] University of Copenhagen(デンマーク)
  • Country Name: DENMARK
  • Counterpart Institution: University of Copenhagen
• [Int'l Joint Research] Washington University School of Medicine(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Washington University School of Medicine
• [Journal Article] Gene expression of nutrient-sensing molecules in I cells of CCK reporter male mice. (2021)
  • Author(s): Kato T, Harada N, Ikeguchi-Ogura E, Sankoda A, Hatoko T, Lu X, Yasuda T, Yamane S, Inagaki N.
  • Journal Title: J Mol Endocrinol. Volume: 66 Pages: 11-22
  • DOI: 10.1530/JME-20-0134.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation and Characterization of a Novel Mouse Model that Allows Spatiotemporal Quantification of Pancreatic β-Cell Proliferation. (2020)
  • Author(s): Tokumoto S, Yabe D, Tatsuoka H, Usui R, Fauzi M, Botagarova A, Goto H, Herrera PL, Ogura M, Inagaki N.
  • Journal Title: Diabetes. Volume: 69 Pages: 2340-2351
  • DOI: 10.2337/db20-0290.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Transcriptome Analysis Dissects the Replicating Process of Pancreatic Beta Cells in Partial Pancreatectomy Model (2020)
  • Author(s): Tatsuoka H, Sakamoto S, Yabe D, Kabai R, Kato U, Okumura T, Botagarova A, Tokumoto S, Usui R, Ogura M, Nagashima K, Mukai E, Fujtani Y, Watanabe A, Inagaki N
  • Journal Title: iScience Volume: 23 Pages: 101774
  • DOI: 10.1016/j.isci.2020.101774.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Absence of GIP secretion alleviates age-related obesity and insulin resistance. (2020)
  • Author(s): Kanemaru Y, Harada N, Shimazu-Kuwahara S, Yamane S, Ikeguchi E, Murata Y, Kiyobayashi S, Hatoko T, Inagaki N.
  • Journal Title: J Endocrinol. Volume: 245 Pages: 13-20
  • DOI: 10.1530/JOE-19-0477.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Phosphoglycerate Mutase Cooperates with Chk1 Kinase to Regulate Glycolysis. (2020)
  • Author(s): Mikawa T, Shibata E, Shimada M, Ito K, Ito T, Kanda H, Takubo K, Lleonart ME, Inagaki N, Yokode M, Kondoh H.
  • Journal Title: iScience. Volume: 23 Pages: 101306
  • DOI: 10.1016/j.isci.2020.101306.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Enteroendocrine K Cells Exert Complementary Effects to Control Bone Quality and Mass in Mice. (2020)
  • Author(s): Gobron B, Bouvard B, Vyavahare S, Blom LV, Pedersen KK, Windelov JA, Boer GA, Harada N, Zhang S, Shimazu-Kuwahara S, Wice B, Inagaki N, Legrand E, Flatt PR, Chappard D, Hartmann B, Holst JJ, Rosenkilde MM, Irwin N, Mabilleau G.
  • Journal Title: J Bone Miner Res. Volume: 35 Pages: 1363-1374
  • DOI: 10.1002/jbmr.4004.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Rb and p53 Execute Distinct Roles in the Development of Pancreatic Neuroendocrine Tumors. (2020)
  • Author(s): Yamauchi Y, Kodama Y, Shiokawa M, Kakiuchi N, Marui S, Kuwada T, Sogabe Y, Tomono T, Mima A, Morita T, Matsumori T, Ueda T, Tsuda M, Nishikawa Y, Kuriyama K, Sakuma Y, Ota Y, Maruno T, Uza N, Masuda A, Tatsuoka H, Yabe D, Minamiguchi S, Masui T, Inagaki N, Uemoto S, Chiba T, Seno H.
  • Journal Title: Cancer Res. Volume: 80 Pages: 3620-3630
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-19-2232.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Association of glucagon-like peptide-1 receptor-targeted imaging probe with in vivo glucagon-like peptide-1 receptor agonist glucose-lowering effects. (2020)
  • Author(s): Murakami T, Fujimoto H, Fujita N, Hamamatsu K, Yabe D, Inagaki N.
  • Journal Title: J Diabetes Investig. Volume: 11 Pages: 1448-1456
  • DOI: 10.1111/jdi.13281.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Is C-type natriuretic peptide regulated by a feedback loop? A study on systemic and local autoregulatory effect. (2020)
  • Author(s): Ueda Y, Hirota K, Yamauchi I, Hakata T, Yamashita T, Fujii T, Yasoda A, Inagaki N.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 15 Pages: e0240023
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0240023.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Maternal Supplementation of Tetrahydrobiopterin Regulates Differentiation of Fetal Brown Adipose Tissue and Contributes to Offspring Metabolic Health (2020)
  • Author(s): Minamino H, Fujita Y, Goto H, Ohashi A, Furuya F, Isomura N, Takesue K, Li Y, Kawarasaki S, Kawada T, Hasegawa H, Inagaki N.
  • Organizer: American Diabetes Association (ADA) 80th Scientific Sessions
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Exome Sequencing in a Family with Multiple Cases of Early-Onset Diabetes Reveals a Candidate Causative Mutation in the PTF1A Gene. (2020)
  • Author(s): Daisuke Tanaka, Saki Okamoto, Yanyan Liu, Katsumi Iizuka, Yoshiyuki Hamamoto, Yukio Horikawa, Daisuke Yabe and Nobuya Inagaki
  • Organizer: American Diabetes Association (ADA) 80th Scientific Sessions
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Whole-exome sequencing in a family with multiple cases of early-onset diabetes reveals a candidate causative mutation in the PTF1A gene. (2020)
  • Author(s): Daisuke Tanaka, Saki Okamoto, Yanyan Liu, Katsumi Iizuka, Yoshiyuki Hamamoto, Yukio Horikawa, Daisuke Yabe and Nobuya Inagaki
  • Organizer: The 56th European Association for the Study of Diabetes (EASD) Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] テトラヒドロビオプテリンは胎児期の褐色脂肪組織の分化を制御し、出生後の糖及びエネルギー代謝に関与する. (2020)
  • Author(s): 南野 寛人、藤田 義人、小栗 靖生、大橋 晶子、後藤 剛、川原崎聡子、古谷 太志、磯村 望、武居 晃平、李 瀛、河田 照雄、長谷川宏幸、稲垣 暢也
  • Organizer: 第23回日本病態栄養学会年次学術集会
• [Presentation] テトラヒドロビオプテリンは胎児期より褐色脂肪組織の分化を制御し、出生後の糖・エネルギー代謝に関与する. (2020)
  • Author(s): 南野 寛人、藤田 義人、小栗 靖生、大橋 晶子、後藤 剛、川原崎聡子、古谷 太志、磯村 望、武居 晃平、李 瀛、河田 照雄、長谷川宏幸、稲垣 暢也
  • Organizer: 第34回日本糖尿病・肥満動物学会年次学術集会
• [Presentation] 若年発症非肥満糖尿病患者における、網羅的次世代シーケンスを用いた発症原因遺伝子変異の検討 (2020)
  • Author(s): 田中 大祐, 稲垣 暢也
  • Organizer: 第63回日本糖尿病学会年次学術集会
• [Presentation] テトラヒドロビオプテリンは胎児期より褐色脂肪組織の分化に関与し，出生後の糖・エネルギー代謝に持続的な影響を与える (2020)
  • Author(s): 南野 寛人、藤田 義人、小栗 靖生、大橋 晶子、後藤 剛、川原崎 聡子、古谷 太志、磯村 望、武居 晃平、李 瀛、河田 照雄、長谷川 宏幸、稲垣 暢也.
  • Organizer: 第63回 日本糖尿病学会年次学術集会
• [Presentation] テトラヒドロビオプテリンは胎仔期の褐色脂肪組織の分化を制御し、出生後の糖及びエネルギー代謝に関与する (2020)
  • Author(s): 南野 寛人、藤田 義人、小栗 靖生、大橋 晶子、後藤 剛、川原崎 聡子、古谷 太志、磯村 望、武居 晃平、李 瀛、長谷川 宏幸、河田 照雄、稲垣 暢也.
  • Organizer: 第59回 日本栄養・食糧学会近畿支部大会
• [Presentation] 化合物スクリーニングを用いた甲状腺ホルモン脱ヨード酵素の新規調節因子の探索 (2020)
  • Author(s): 山内 一郎、坂根 依利子、伯田 琢郎、山下 貴史、植田 洋平、藤井 寿人、八十田 明宏、稲田 暢也
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] TSH受容体とIGF1受容体のcAMP産生における相互作用 機能獲得型変異を用いた検討 (2020)
  • Author(s): 山内 一郎、伯田 琢郎、山下 貴史、植田 洋平、藤井 寿人、八十田 明宏、稲垣 暢也
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] 甲状腺ホルモン不応症におけるベザフィブラートによる甲状腺機能低下症 マウスモデルの作成と解析 (2020)
  • Author(s): 山内 一郎、山下 貴史、伯田 琢郎、植田 洋平、藤井 寿人、稲垣 暢也
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] グルココルチコイド誘発性成長障害モデルマウスに対するC型ナトリウム利尿ペプチドの骨伸長障害改善効果の検討 (2020)
  • Author(s): 植田洋平、八十田明宏、伯田琢郎、山内一郎、藤井寿人、稲垣暢也
  • Organizer: 第38回日本骨代謝学会学術集会
• [Presentation] TSH過剰発現マウスの作成と甲状腺機能に関する検討 (2020)
  • Author(s): 山内 一郎、伯田 琢郎、植田 洋平、藤井 寿人、稲垣 暢也
  • Organizer: 第63回日本甲状腺学会学術集会