2020 Fiscal Year Research-status Report
Identification of pathogenesis of ovarian clear cell carcinoma by topographic single cell sequencing
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20K21647
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
榎本 隆之 新潟大学, 医歯学系, 教授 (90283754)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井ノ上 逸朗 国立遺伝学研究所, ゲノム・進化研究系, 教授 (00192500)
吉原 弘祐 新潟大学, 医歯学系, 研究准教授 (40547535)
安達 聡介 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (50613147)
田村 亮 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (70650620)
石黒 竜也 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (80625690)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| Keywords | シングルセルシークエンス / 卵巣癌 / 子宮内膜症 / 癌遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、卵巣明細胞癌症例の子宮内膜症から卵巣明細胞癌に移行する部位に注目し、同部位のゲノム・エピゲノム異常を単一細胞レベルで同定することを目的としている。移行部位から単一細胞をレーザーマイクロダイセクションで一つずつ切り出し、微量DNAを用いたシークエンス解析を行う。位置情報を反映した単一細胞シークエンス解析により、子宮内膜症から卵巣明細胞癌に移行するにつれて蓄積されるゲノム・エピゲノム異常を明らかにし、卵巣明細胞癌の発症メカニズムを解明する。今年度は、卵巣明細胞癌サンプル収集に加え、卵巣明細胞癌の発生起源である子宮内膜症、さらにその起源である正常子宮内膜についてサンプリングを実施した。特に明細胞癌の一例で、正常子宮内膜、子宮内膜症、異型内膜症、明細胞癌の上皮細胞をレーザーマイクロダイセクションで回収し、全エクソンシークエンス解析を行い、正常子宮内膜から明細胞癌でのゲノム異常の連続性を明らかにした。次に、正常子宮内膜の腺管上皮一本をレーザーマイクロダイセクションで回収し、微量DNAからライブラリー作成を行い、全ゲノムシークエンスシークエンス実験を行った。全ゲノムシークエンスデータを用いて、子宮内膜の腺管上皮の増殖・再生の方向性をトレーシングし、子宮内膜の再生メカニズムおよび内膜の区域性を明らかにすることが可能であった。レーザーマイクロダイセクション後の細胞から微量DNA抽出およびライブラリー作成、シークエンスが可能であることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の計画の通り、おおむね順調に進んでいる。特に、レーザーマイクロダイセクション後の細胞から微量DNA抽出およびライブラリー作成、シークエンスが課題であったが、DNA抽出方法およびライブラリー作成方法を工夫することで対応可能であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究計画は以下の通りである。
1. 子宮内膜症から卵巣明細胞癌への移行部位からの単一細胞の切り出し：引き続き、子宮内膜症から卵巣明細胞癌へ移行する部位を同定する。同部位よりレーザーマイクロダイセクション法を用いて細胞を一つずつ切り出し、各細胞の腫瘍組織内の位置情報を記録する。
2. 単一細胞シークエンス実験および解析：単一細胞の全ゲノム増幅後、Illumina社 HiSeq3000を用いて全ゲノムシー
クエンスを行う。独自に開発したパイプラインを用いて遺伝子変異・コピー数異常・融合遺伝子などのゲノム異常を同定する。全ゲノムバイサルファイトシークエンスを行い、メチル化プロファイルを取得する。細胞毎に取得されたデータと腫瘍組織内の位置情報を紐付けし、進化論的アプローチにより、内膜症から癌に移行するにつれて蓄積されるゲノム・エピゲノム異常を同定する。さらにSPARIAL GENE EXPRESSION法を用いて同定されたゲノム・エピゲノム異常に対応する遺伝子発現変化を組織上で可視化し、検証する。
3. 子宮内膜症オルガノイドを用いた卵巣明細胞癌の原因遺伝子の同定：引き続き、子宮内膜症オルガノイド作成を継続する。子宮内膜症オルガノイドに原因遺伝子変異を導入し、遺伝子導入前後でオルガノイドの細胞増殖能・浸潤転移能などの表現型の変化を検証する。
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| Causes of Carryover |
本研究ではシークエンス費用が高額なため、予定より消耗品を節約した。その分の予算を次年度に繰り越すことによって、来年度に多くの症例をシークエンスできるように変更した。
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