2022 Fiscal Year Annual Research Report
骨芽細胞分化能を指標とした骨代謝制御因子PRIPの阻害剤の探索
| Project/Area Number |
20K21681
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
松田 美穂 九州大学, 歯学研究院, 准教授 (40291520)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
|
| Keywords | 骨芽細胞 / 分化 / PRIP / 阻害因子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
前年度より、作製したALP-T2A-GFPコンストラクトを用いたノックイン(KI)細胞作製を行なったが、骨芽細胞分化誘導により生じることが予想されるGFPの発現が見られなかったため、新たに薬剤耐性遺伝子を導入したコンストラクトを作製し、ノックイン細胞を作製した。しかしながらノックインの効率が悪く、薬剤耐性で選別されたクローンにおけるGFP発現を検討したが該当する細胞が得られなかった。骨芽細胞分化と共に発現量が上昇するALP遺伝子はおそらく、細胞が未分化状態ではクロマチン構造が凝縮していて、さらに挿入部位がその遺伝子の下流というピンポイントであることもあり、外来遺伝子を挿入することが非常に難しい可能性が示唆された。そこで、挿入部位をマウスROSA26領域に替え、GFP遺伝子の上流に、同じく骨芽細胞分化とともに発現が誘導されるBglap遺伝子のプロモーター領域を入れたコンストラクトを構築し、ノックイン細胞を作製した。クローン化した細胞からゲノムDNA を抽出しシーケンス解析を行い、複数のKI細胞クローンを確認した。こられについて分化誘導を行い、GFP発現を確認した。
また、KI細胞を用いてコンパウンドライブラリーのスクリーニングを行った後、阻害剤候補として絞り込まれたコンパウンドについて検討する際に必要なPRIPノックアウト（KO)細胞の作製を行った。EF1a-Puro-SV40 pAコンストラクトの作製、ガイドRNAの設計を行い、PRIP2遺伝子のexon2へ挿入した。クローン化した細胞からゲノムDNAを抽出しシーケンス解析からInsert/Deletionの確認を行い、複数のKO細胞クローンを得た。
|
-
-
[Journal Article] Deletion of epithelial cell-specific p130Cas impairs the maturation stage of amelogenesis2022
Author(s)
Inoue A, Kiyoshima T, Yoshizaki K, Nakatomi C, Nakatomi M, Ohshima H, Shin M, Gao J, Tsuru K, Okabe K, Nakamura I, Honda H, Matsuda M, Takahashi I, Jimi E.
-
Journal Title
Bone
Volume: 154
Pages: 116210
DOI
Peer Reviewed / Open Access
-
-
