2020 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of stem cell functions in salivary glands
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20K21688
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
美島 健二 昭和大学, 歯学部, 教授 (50275343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 準一 昭和大学, 歯学部, 講師 (40710166)
行森 茜 昭和大学, 歯学部, 助教 (60813748)
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| Project Period (FY) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 唾液腺 / 幹細胞老化 / シングルセル解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度は、老齢マウスおよび唾液腺幹細胞障害モデルとして放射線照射マウスの顎下腺細胞をそれぞれscRNA seqにより解析し、若齢マウスの幹細胞分画と遺伝子発現を比較する目的で研究が実施された。そのため、まず予備的検討として、C57BL/6マウス（8週齢）より顎下腺組織を摘出し、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼで処理後Tryple（Invitrogen）にて細胞を分散化した。次に、分散化した細胞をヘキストおよびPropidium Iodideで染色後 SMARter ICELL8 cx Single-Cell System（TAKARA）によりsingle cellに単離後、生細胞を選別しcDNA合成とsequenceライブラリーを作製した。さらに、イルミナ社製次世代シークエンサー（HiSeq2500）により遺伝子配列情報を取得した。次に、tSNE 解析により唾液腺細胞のクラスタリングを行った。得られたデータの信頼性を検証する目的で、最近、NIHのBerinda等が報告したマウス顎下腺のscRNAseq解析結果（iScience, 2020）と比較検討した。その結果、Berinda等の報告では、解析された細胞の70％から80％が上皮細胞であるのに対して、我々の解析では間質細胞の割合が高く、細胞分散方法の見直しが必要であることが明らかとなった。そこで我々もBerinda等の方法に準じて、細胞の分散化にコラゲナーゼとヒアルロニダーゼの酵素処理のみならず、新たにmilteny gentleMACS Octo Dissociatorを用いた機械的な分散化を加え、良好な結果を得ることができた。本手法を用いて老齢マウス（80週齢）および唾液腺障害モデルとして放射線照射（顎下腺局所、15Gy）マウスの顎下腺細胞の分散化を行いscRNAseqを進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、まず、老齢マウスおよび放射線照射マウスの顎下腺細胞におけるscRNAseq解析を行うため若齢マウスを用いた試験的なscRNAseq解析を行った。その結果、我々の解析結果と既出論文の結果を比較すると、間質細胞の割合が異なる事が判明した。このことは、顎下腺細胞の分散化方法が異なる事に起因する事が想定され、顎下腺の分散方法を再度調整する必要が生じた。このため、老齢マウスおよび放射線照射マウスの顎下腺細胞のscRNAseq解析の実施が本年度から次年度にずれ込んだため。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の予備的検討により、マウス顎下腺細胞の分散方法が確立されたので、本年度は確立された方法を用いて、老齢マウス（80週齢）および唾液腺障害モデルとして放射線照射（顎下腺局所、15Gy）マウスから採取した顎下腺のscRNAseq解析を行い唾液腺幹細胞老化に関連する候補遺伝子を特定する。この際、既に多くの組織に存在する成体幹細胞の機能障害を誘導することが知られている放射線照射と共通の変動遺伝子と比較検討することにより、より効率よく幹細胞老化関連遺伝子の絞り込みを行いたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
当該年度中に老齢マウスと放射線照射マウス顎下腺のscRNAseq解析を受託する予定であった。しかしながら、正常マウスのpreliminaryなscRNAseqの解析結果より、細胞の分散化を再検討する必要性が明らかとなり、前述の受託解析の実施が次年度実施にずれ込んでしまった事による。
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