臓器の恒常性維持と再生におけるYAP活性化の機械的制御機構の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K22657
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 田尾 嘉誉 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (30425417)
• Project Period (FY): 2020-09-11 – 2022-03-31
• Keywords: YAP / 臓器ホメオスターシス / イメージング・マスサイトメトリー法

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、ヒト・マウス生体内で臓器ホメオスターシスを維持する過程でのYAPメカノホメオスターシスのダイナミクスを解析する事である。そのために下記の三つの主要解析系を立ち上げる計画を実行中である。１）YAP活性化の時空間的解析、２）生体の力学特性、力学応答とYAP活性化との関連性の定量的解析、３）YAP活性化細胞の種類と機能解析とりわけ、１）の解析に該当する新規性の高い技術イメージング・マスサイトメトリー法の条件検討に集中した。その意義は、YAPの活性化と細胞外マトリックス構成因子および 免疫細胞群とのタンパク発現の相関関係を“微細環境下の細胞集団”として分類化し、がん細胞の性質を明らかにすることである。そのために、最大37タンパク質の時空間的発現様式を同一標本サンプルで同定・解析可能なイメージング・マスサイトメトリー法を用いて、ヒトがん標本(大腸がん、膵臓がん肝臓転移)切片上における解析を継続的に行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、がん進展の進行状況と硬さ(細胞外物理特性)とYAPの活性化における分子メカニズムをYAP恒常性維持の崩壊と捉えて、イメージング・マスサイトメトリー、シングル遺伝子解析および新規性の高い三次元的力学測定法を用いて解明する。現在までの研究進捗状況を下記に記す。
１）生体の力学特性、力学応答とYAP活性化との関連性の定量的解析
YAP 活性化を可視 化できるトランスジェニックマウス作成が困難であったため、生体における一細胞レベルでの時空間的活性化が不明であった。最近開発された YAPレポーターマウス(Dr. Bin Gu と共同研究進行中であり、未発表)あるいは YAPレポーター・オルガノイドを独自に作成し、3Dライブイメージング技術により、がん発症・進展における YAP の活性化の局在ダイナミクス(核移行)を定量的に解析する。 マウスオルガノイド（膵臓、大腸、肝臓）作成は本研究室にて既に樹立した。YAPレポーターマウスの作成は前述のDr. Bin Guとの共同研究は継続中であり、国内でも共同研究者とともに作成を既にスタートさせている。
２）YAP活性化の時空間的解析およびYAP活性化細胞の種類と機能解析
現在までにFluidigm社との各種抗体の選別は終了し、二つのがん標本（大腸がん、膵臓転移肝臓がん）を用いた予備実験は終了している。今後継続して各種抗体の最適条件を見出していく予定である。

Strategy for Future Research Activity

継続して下記の独自性の高い３つの技術により解析を進める。
(I)皮膚再生過程でのYAP活性化の時空間的解析: 生体で観察のしやすい皮膚損傷治癒過程で、どの時期にどの細胞でYAPの活性化が起こるかを明らかにする。①YAPレポーターマウスYap-mScarletと核レポーターH2B-GFPマウスを交配し、Yap-mScarlet；H2B-GFPマウス系統を作成。②このマウスの背中の皮膚のパンチ法による損傷を起こす。③多光子顕微鏡を用いてYAPの核移行によりYAP活性化を検出・評価する。
(II)生体の力学特性、力学応答とYAP活性化との関連性の定量的解析:　①あらかじめ複数のMagnetic beadsを注入した皮膚に人為的に損傷を起こす。治癒過程においてMagnetic beads周辺の細胞の②Vinculinテンションセンサーのイメージングにより細胞の力学応答、③(I)を用いてYAPの活性化を定量化する。④更に、磁場をかけてMagnetic beadsの動きを測定することにより、周辺細胞での力学応答を定量化する。
(III)YAP活性化細胞の種類と機能解析:　皮膚治癒の複数の過程においてシングルセルRNAシーケンシングを行う。①YAPが活性化した細胞をYAP標的遺伝子の発現を指標に同定する。②それらの細胞での遺伝子発現解析により、その細胞の種類と機能を推測する。③その細胞特異的に発現する遺伝子をプローブにしてin situ ハイブリダイゼーションにより、それらの細胞の損傷治癒過程での分布を明らかにする。

Causes of Carryover

研究実行のための優先順位の選定をまず、イメージング・マスサイトメトリー法の条件検討およびヒト標本サンプルの調整、マウスオルガノイド作成のために時間を費やしたため、当初の予定とは物品使用額に差額が生じた。この未使用額については、令和3年度の研究費と併せて、YAPレポーターマウスおよびオルガノイドを用いたライブイメージング解析に用いる消耗品の購入に充てる。