2020 Fiscal Year Research-status Report
モンゴルにおける小型反芻獣トキソプラズマ症のワクチン開発研究
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20KK0152
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| Research Institution | Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine |
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Principal Investigator |
西川 義文 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (90431395)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邉 謙一 帯広畜産大学, 畜産学部, 助教 (10761702)
二瓶 浩一 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 研究員 (40373344)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2025-03-31
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| Keywords | 原虫 / トキソプラズマ / ワクチン / モンゴル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モンゴルでは様々な家畜感染症が発生しており、家畜疾病に対する予防・対策のニーズは高く、早急な対応が必要となっている。特に家畜における繁殖障害は経済的な損害が大きく、これに関連する病原性原虫としてトキソプラズマの存在が示唆されている。そこで本研究では、モンゴルの重要な家畜資源である小型反芻獣に着目し、トキソプラズマ感染に対する新しいワクチンの開発を目指す。モンゴル由来原虫株を分離し、細胞スクリーニング法による免疫刺激型抗原の同定、プロテオームによる自然感染動物で認識される感染認識抗原の同定を進め、これら抗原を組み合わせたカクテルワクチンの開発を進める。さらに、遺伝子破壊原虫の解析で新規ワクチン抗原の機能を理解し、小型反芻獣への感染実験を通じて新規ワクチンの効果と防御免疫反応の詳細を明らかにする。これまでに以下の研究課題を実施した。
【モンゴル原虫株の検出と分離】トキソプラズマ感染と流産が発症している対象地域の遊牧民・農家の協力を得て、ヒツジとヤギの流産胎仔サンプルを収集した。遺伝子検査を実施し、トキソプラズマの遺伝子を検出に成功した。
【ワクチン用抗原の同定】免疫反応の活性化を評価できる細胞スクリーニング系を構築し、宿主免疫を活性化させるトキソプラズマ遺伝子TgGRA7, TgGRA14, TgGRA15を同定した。また、Toll様受容体のリガンドとして機能するトキソプラズマprofilinについてビタミンEと脂質ナノ粒子を使用したDNAワクチンを作製し、マウスの感染実験にて感染防御効果を得ることに成功した。感染認識抗原の同定のため、ヒト血清を用いたイムノプロテオームを実施し、候補抗原を同定した。また、トキソプラズマの分泌器官であるデンスグラニュルおよびロプトリーの遺伝子を導入した細胞ELISA系を構築し、ヒト血清に反応する抗原を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【モンゴル原虫株の検出と分離】我々はモンゴルにおけるフィールド調査によりトキソプラズマ感染と流産が発症している地域を突き止めている。そこで対象地域の遊牧民・農家の協力を得て、ヒツジとヤギの流産胎仔サンプルを収集した。モンゴル生命科学大学・獣医学研究所にて遺伝子検査を実施し、トキソプラズマの遺伝子を検出に成功した。この結果により、モンゴルにおいてトキソプラズマ感染と流産の発生の関連性が示唆された。
【ワクチン用抗原の同定】免疫刺激型抗原をスクリーニングするために、免疫反応の活性化を評価できる細胞スクリーニング系を構築した。宿主免疫を活性化させるNFkBシグナルに着目し、トキソプラズマ遺伝子TgGRA7, TgGRA14, TgGRA15を同定した。これら遺伝子破壊原虫株はマウスに対する病原性が増加しており、当該分子による宿主免疫の活性化が防御免疫に必要であることが示された。また、Toll様受容体のリガンドとして機能するトキソプラズマprofilinについてビタミンEと脂質ナノ粒子を使用したDNAワクチンを作製した。マウスの感染実験にて感染防御効果を検証したところ、対象マウスの生存率は30%であったのに対し、ワクチン接種マウスの生存率は90%であり、極めて有効な結果を得ることができた。感染認識抗原の同定のため、ヒト血清を用いたイムノプロテオームを実施し、候補抗原を７種類選定した。また、トキソプラズマの分泌器官であるデンスグラニュルおよびロプトリーの遺伝子を導入した細胞ELISA系を構築し、ヒト血清に反応する候補抗原を2種類選定した。これら候補抗原については、大腸菌発現系にて組換えタンパク質の作製に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は以下の研究課題を実施する。
【モンゴル原虫株の検出と分離】モンゴルにおいてトキソプラズマ感染と流産の発生の関連性が示唆されたため、対象地域の遊牧民・農家の協力を得て、ヒツジとヤギの流産胎仔サンプルの収集を継続する。トキソプラズマ症と診断された組織サンプルについては乳剤を作製し、実験マウスへ接種することで原虫分離を試みる。ここでの結果をもとにして、実験感染に使用する動物種（ヒツジあるいはヤギ）を選択する。接種マウス内で原虫の増殖が確認されたら、培養細胞にて順化した分離株を樹立する。分離株は日本へ導入し、ゲノム解析とプロテオームを通じて標準実験株のデータ（TOXODB, https://toxodb.org/toxo/）と比較して遺伝子多型やタンパク質発現レベルの比較による病原性の推定を行う。
【ワクチン用抗原の同定】免疫刺激型抗原TgGRA7, TgGRA14, TgGRA15について、ビタミンEと脂質ナノ粒子を使用したDNAワクチンを作製し、マウスの感染実験にて感染防御効果を検証する。感染認識抗原の同定のため、ヒト血清を用いたイムノプロテオームおよび細胞ELISA系で選定した候補抗原を用いて、ELISAによる抗原性の確認を行う。またモンゴルにおける自然感染ヤギあるいはヒツジ由来血清を日本へ導入し、本血清をプローブとした免疫プロテオームを実施する。上記の方法で同定した抗原をコードする遺伝子をモンゴル分離株からクローニングする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染拡大のため渡航予定であったモンゴルでの調査旅行が中止となったため、旅費を使用しなかった。今年度のモンゴルでの調査旅行に使用する予定である。
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[Journal Article] Toxoplasma gondii Dense Granule Proteins 7, 14, and 15 Are Involved in Modification and Control of the Immune Response Mediated via NF-κB Pathway.2020
Author(s)
Ihara F, Fereig RM, Himori Y, Kameyama K, Umeda K, Tanaka S, Ikeda R, Yamamoto M, Nishikawa Y.
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Journal Title
Front Immunol.
Volume: 11
Pages: 1709
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Vitamin E Scaffolds of pH-Responsive Lipid Nanoparticles as DNA Vaccines in Cancer and Protozoan Infection.2020
Author(s)
Maeta M, Miura N, Tanaka H, Nakamura T, Kawanishi R, Nishikawa Y, Asano K, Tanaka M, Tamagawa S, Nakai Y, Tange K, Yoshioka H, Harashima H, Akita H.
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Journal Title
Mol Pharm.
Volume: 17
Pages: 1237-1247
DOI
Peer Reviewed
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