2009 Fiscal Year Annual Research Report
DNA複製におけるユビキチン化シグナルと分子間相互作用の構造生物学
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21370048
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
佐藤 衛 Yokohama City University, 生命ナノシステム科学研究科, 教授 (60170784)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橋本 博 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 助教 (40336590)
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| Keywords | DNA複製 / DNA損傷応答 / PCNA / ユビキチン化 / 損傷乗り越えDNA合成 / DNAクランプ / 構造解析 |
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| Research Abstract |
DNAクランプのユビキチン化は,損傷乗り越えDNA合成(TLS)やチェックポイントの活性化など,DNA損傷に対する細胞機能を発動させる重要なトリガーである.本研究では2つのDNAクランプ,PCNA及び9-1-1に注目し,DNA損傷応答におけるユビキチン化シグナルと分子間相互作用を構造生物学的に明らかにすることを目指す.平成21年度は,1)ユビキチン化PCNAの調製,2)PCNAの脱ユビキチン化酵素USP1の調製,3)PCNA変異体の機能解析と構造解析を行った.
1)ユビキチン化PCNAを大量に調製し,ナノフローESI法による質量分析(NanoESI MS)を行った.その結果,3量体PCNAの1箇所あるいは2箇所がユビキチン化されていることを確認した.これは,生体内では必ずしも3箇所がユビキチン化される必要がないことを示唆する結果である.また,未修飾の3量体も存在していることがわかり,純度を上げるために発現系及び精製条件のさらなる検討が必要である.
2)USP1はモノユビキチン化されたPCNAを脱ユビキチン化する酵素である.様々な発現ベクターを試した結果,ヒトUSP1を大腸菌を用いて発現させることに成功した.
3)TLSを阻害する酵母PCNA変異体G178S(REV6-1)を調製し,様々な手法により3量体の安定性を調べた.その結果,REV6-1は野生型PCNAに比べて,3量体の安定性が著しく低下していることがわかった.また,結晶構造解析を行ったところ,酵母REV6-1は3量体リングを形成していなかった.ヒトREV6-1のユビキチン化をin vitroで行ったところ,野生型とほぼ同程度にユビキチン化されることがわかった.以上のことから,REV6-1のTLS阻害は,3量体形成の破綻に起因すると考えられる.
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[Journal Article] The structure of the N-terminal regulatory domain of a plant NADPH oxidase and its functional implications2009
Author(s)
Takashi Oda, Hiroshi Hashimoto, Naoyuki Kuwabara, Satoko Akashi, Kokoro Hayashi, Chojiro Kojima, Wong Hann Ling, Tsutomu Kawasaki, Ko Shimamoto, Mamoru Sato, Toshiyuki Shimizu
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Journal Title
J Biol Chem 285
Pages: 1435-45
Peer Reviewed
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[Presentation] ヒトREV7の構造生物学的研究2010
Author(s)
原幸大, 橋本博, 村雲芳樹, 小林俊介, 小亀敏明, 雲財悟, 明石知子, 武田俊一, 清水敏之, 佐藤衛
Organizer
第27回PFシンポジウム
Place of Presentation
つくば国際会議場
Year and Date
20100308-20100309
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[Presentation] ヒト由来Mad2L2の結晶学的研究2009
Author(s)
Kodai Hara, Toshiyuki Shimizu, Yoshiki Murakumo, Tomo Hanafusa, Haruo Ohmori, Mamoru Sato, Hiroshi Hashimoto
Organizer
American Crystallographic Association Meeting
Place of Presentation
Toronto at Canada
Year and Date
20090725-20090730
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