DNA複製におけるユビキチン化シグナルと分子間相互作用の構造生物学

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21370048
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 佐藤 衛 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 教授 (60170784)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 橋本 博 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 助教 (40336590)
• Keywords: DNA複製 / DNA損傷応答 / PCNA / ユビキチン化 / 損傷乗り越えDNA合成 / DNAクランプ / 構造解析

Research Abstract

DNAクランプは,DNA複製や修復において様々なタンパク質をDNA上にリクルートする足場タンパク質である.DNAに損傷が生じると,DNAクランプはコビキチン化を受ける.これが損傷乗り越えDNA合成やテンプレートスイッチなどの損傷トレランス機構を発動させるシグナルであると考えられている.本研究では2つのDNAクランプ(PCNA及び9-1-1)に注目し,DNA複製におけるユビキチン化シグナルと分子間相互作用を構造生物学的に明らかにすることを目指す.本年度に行った研究を以下に示す.
【UAF1】PCNAの脱ユビキチン化酵素USP1の制御因子であるヒトUAF1の調製を行った.大腸菌を用いて様々な発現条件を検討した結果,UAF1をヒスタグ融合タンパク質として発現させることに成功した。UAF1は,アフィニティーカラム,イオン交換カラム,ゲル濾過カラムで精製した.さらに結晶化スクリーニングを行ったところ,PEGを沈殿剤とした条件でUAF1の結晶化に成功した.
【RAD9】9-1-1のサブユニットの1つであるRAD9のC末端ドメイン270-391残基(RAD9CTD)の構造生物学的研究を行った.大腸菌のコドンに最適化したRAD9CTDをGST融合タンパク質として発現させ,アフィニティーカラム,イオン交換カラム,ゲル濾過カラムで精製を行った.得られた試料を用い,X線小角散乱実験を行い,散乱曲線からクラツキープロットを計算した.また,遠紫外CDスペクトルを測定した.それらの結果から,RAD9CTDは100残基を超える大きさを持つが,一定の構造をとらない天然変性タンパク質であることが明らかになった.RAD9CTDは高度にリン酸化修飾を受ける.したがって,RAD9CTDが天然変性状態であることは,リン酸化修飾には都合がよい構造であるといえる.

Research Products

• [Journal Article] Identification of a small molecule PCNA inhibitor that disrupts interactions with PIP-Box proteins and inhibits DNA replication (2012)
  • Author(s): Chandanamali Punchihewa, Akira Inoue, Asami Hishiki, Yoshihiro Fujikawa, Michele Connelly, Benjamin Evison, Youming Shao, Richard Heath, Isao Kuraoka, Patrick Rodrigues, Hiroshi Hashimoto, Masanobu Kawanishi, Mamoru Sato, Takashi Yagi, Naoaki Fujii
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 287 Pages: 14289-14300
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.353201
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A (2011)
  • Author(s): H.Tachiwana, W.Kagawa, T.Shiga, A.Osakabe, Y.Miya, K.Saito, Y.Hayashi-Takanaka, T.Oda, M.Sato, S.-Y.Park, H.Kimura, H.Kurumizaka
  • Journal Title: Nature Volume: 476 Pages: 232-235
  • DOI: 10.1038/nature10258
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Towards the Structural Characterization of Intrinsically Disordered Proteins by SAXS and MD Simulation (2011)
  • Author(s): T.Oroguchi, M.Ikeguchi, M.Sato
  • Journal Title: J.Physics : Conference Series Volume: 272 Pages: 012005
  • DOI: 10.1088/1742-6596/272/1/012005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Relationship between heat-induced fibrillogenicity and hemolytic activity of thermostable direct hemolysin and a related hemolysin of Vibrio parahaemolyticus (2011)
  • Author(s): Kiyouhisa Ohnishi, Kumiko Nakahira, Satoru Unzai, Kouta Mayanagi, Hiroshi Hashimoto, Kentaro Shiraki, Takeshi Honda, Itaru Yanagihara
  • Journal Title: FEMS Microbiol Lett Volume: 318 Pages: 10-17
  • DOI: 10.1111/j.1574-6968.2011.02233.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel heterotetrameric structure of the crenarchaeal PCNA2-PCNA3 complex (2011)
  • Author(s): Akito Kawai, Hiroshi Hashimoto, Shigesada Higuchi, Masaru Tsunoda, Mamoru Sato, Kazuo T Nakamura, Shuichi Miyamoto
  • Journal Title: J Struct Biol Volume: 174 Pages: 443-450
  • DOI: 10.1016/j.jsb.2011.02.006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of bacis 7S globurin, a xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase inhibitor protein-like protein from soybean lacking inhibitory activity against endo-beta-glucanase (2011)
  • Author(s): Takuya Yoshizawa, Toshiyuki Shimizu, Mayuki Yamabe, Misako Taichi, Yuji Nishiuchi, Naoki Shichijo, Satoru Unzai, Hisashi Hirano, Mamoru Sato, Hiroshi Hashimoto
  • Journal Title: FEBS J Volume: 278 Pages: 1944-1954
  • DOI: 10.1111/j.1742-4658.2011.08111.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Purification, crystallization and X-ray diffraction study of extracellular dermal glycoprotein from carrot and the inhibition complex it forms with an endo-beta-glucanase from Aspergillus aculeatus (2011)
  • Author(s): Takuya Yoshizawa, Toshiyuki Shimizu, Hisashi Hirano, Mamoru Sato, Hiroshi Hashimoto
  • Journal Title: Acta Cryatallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun Volume: 67 Pages: 830-832
  • DOI: 10.1107/S1744309111020045
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis for matrix metalloproteinase-2 (MMP-2)-selective inhibitory action of beta-amyloid precursor protein-derived inhibitor (2011)
  • Author(s): Hiroshi Hashimoto, Tomoka Takeuchi, Kyoko Komatsu, Kaoru Miyazaki, Mamoru Sato, Shouichi Higashi
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 286 Pages: 33236-33243
  • DOI: 10.1074/jbc.M111.264176
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The Development of N-α-(2-Carboxyl)benzoyl-N5-(2-fluoro-1-iminoethyl)-L-ornithine Amide (o-F-amidine) and N-α-(2-Carboxyl)benzoyl-N5-(2-chloro-1-iminoethyl)l-ornithine Amide (o-Cl-amidine) As Second Generation Protein Arginine Deiminase (PAD) Inhibitors (2011)
  • Author(s): Corey P.Causey, Justin E.Jones, Jessica L.Slack, Daisuke Kamei, Larry E.Jones, Jr., Venkataraman Subramanian, Bryan Knuckley, Pedram Ebrahimi, Alexander A.Chumanevich, Yuan Luo, Hiroshi Hashimoto, Mamoru Sato, Lorne J.Hofseth, Paul R.Thompson
  • Journal Title: J Med Chem Volume: 54 Pages: 6919-6935
  • DOI: 10.1021/jm2008985
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mechanistic insights into the activation of rad51-mediated strand exchange from the structure of a recombination activator, the swi5-sfr1 complex (2011)
  • Author(s): Naoyuki Kuwabara, Yasuto Murayama, Hiroshi Hashimoto, Yuuichi Kokabu, Mitsunori Ikeguchi, Mamoru Sato, Kouta Mayanagi, Yasuhiro Tsutsui, Hiroshi Iwasaki, Toshiyuki Shimizu
  • Journal Title: Structure Volume: 20 Pages: 440-449
  • DOI: 10.1016/j.str.2012.01.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fission yeast Swi5-Sfr1 protein complex, an activator of Rad51 recombinase, forms an extremely elongated dogleg-shaped structure (2011)
  • Author(s): Yuichi Kokabu, Yasuto Murayama, Naoyuki Kuwabara, Tomotaka Oroguchi, Hiroshi Hashimoto, Yasuhiro Tsutsui, Naohito Nozaki, Satoko Akashi, Satoru Unzai, Toshiyuki Shimizu, Hiroshi Iwasaki, Mamoru Sato, Mitsunori Ikeguchi
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 286 Pages: 43569-43576
  • DOI: 10.1074/jbc.M111.303339
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] タンパク質の核内輸送の構造基盤 (2011)
  • Author(s): 佐藤衛
  • Journal Title: 生体の科学 Volume: 62 Pages: 492-493
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] X線溶液散乱と分子動力学シミュレーションでみるタンパク質の揺らぎ (2011)
  • Author(s): 佐藤衛
  • Journal Title: 高分子 Volume: 60 Pages: 798-800
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ニンジンEDGPの麹菌キシログルカン特異的エンドグルカナーゼ阻害機構 (2012)
  • Author(s): 吉澤拓也、清水敏之、平野久、橋本博、佐藤衛
  • Organizer: 第29回PFシンポジウム
  • Place of Presentation: つくば国際会議場
  • Year and Date: 20120315-20120316
• [Presentation] Towards the structural characterization of intrinsically disordered proteins by SAXS and MD simulation (2011)
  • Author(s): Mamoru Sato
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(招待講演)
  • Year and Date: 20111213-20111216
• [Presentation] Biochemical and structural analyses of the nucleosome in transcriptionally active region (2011)
  • Author(s): Yusuhiro Arimura, Hiroaki Tachibana, Takashi Oda, Mamoru Sato, Hitoshi Kurumizaka
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 20111213-20111216
• [Presentation] Crystal structure and biochemical property of the human centromere specific nucleosome (2011)
  • Author(s): Hiroaki Tachibana, Wataru Kagawa, Tatsuya Shiga, Ryohei Matsumoto, Yuta Miya, Akihisa Osakabe, Yoko Hayashi-Takanaka, Takashi Oda, Mamoru Sato, Sam-Yong Park, Hiroshi Kimura, Hitoshi Kurumizaka
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 20111213-20111216
• [Presentation] ニンジンEDGPによる麹菌XEGの阻害複合体構造 (2011)
  • Author(s): 吉澤拓也, 橋本博, 清水敏之, 平野久, 佐藤衛
  • Organizer: 平成23年度日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 北海道大学学術交流会館(札幌市)
  • Year and Date: 20111124-20111125
• [Presentation] Structure of REV7 in complex with a REV3 fragment and structural implication of the interaction between DNA polymerase F Nf and REV1 (2011)
  • Author(s): Hiroshi Hashimoto, Kodai Hara, Yoshiki Murakumo, Shunsuke Kobayashi, Toshiaki Kogame, Satoru Unzai, Satoko Akashi, Shunichi Takeda, Toshiyuki Shimizu, Mamoru Sato
  • Organizer: Current Opinion in Structural Biology & DNA Repair, A Current Opinion in Structural Biology conference
  • Place of Presentation: NH Grand Hotel Krasnapolsky, Amsterdam, Netherlands
  • Year and Date: 20111016-20111018
• [Presentation] APP由来インヒビターペプチドによるMMP-2選択的阻害機構の解明 (2011)
  • Author(s): 竹内友香、橋本博、宮崎香、佐藤衛、東昌市
  • Organizer: 第84回日本生化学会
  • Place of Presentation: 京都国際会館
  • Year and Date: 20110921-20110924
• [Presentation] SAXS to Investigate Protein Flexibility and Intrinsic Disorder in Solution (2011)
  • Author(s): Mamoru Sato
  • Organizer: The 3th Asian Symposium on Advance Materials : Chemistry & Physics of Functional Materials (ASAM-3)
  • Place of Presentation: Kyushu University (Chikushi-campus)(招待講演)
  • Year and Date: 20110919-20110922
• [Presentation] Analysis on dynamical structure of intrinsically disordered protein Hef, using MD-SAXS method (2011)
  • Author(s): T.Oroguchi, T.Oda, H.Hashimoto, Y.Ishino, M.Ikeguchi, M.Sato
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学・姫路書写キャンパス
  • Year and Date: 20110916-20110918
• [Presentation] MMP-2とAPP由来インヒビターペプチドとの複合体の結晶構造解析 (2011)
  • Author(s): 竹内友香、橋本博、宮崎香、佐藤衛、東昌市
  • Organizer: 第16回日本病態プロテアーゼ学会学術集会2011
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター
  • Year and Date: 20110826-20110827
• [Presentation] Structural basis of inhibition mechanism by carrot EDGP against GH12. The inhibitory structure of carrot EDGP against endoglucanase from A.aculeatus (2011)
  • Author(s): Takuya Yoshizawa, Toshiyuki Shimizu, Hisashi Hirano, Mamoru Sato, Hiroshi Hashimoto
  • Organizer: XXII Congress of the International Union of Crystallography
  • Place of Presentation: Palacio Municipal de Congresos de Madrid/Municipal Conference Centre
  • Year and Date: 20110822-20110830
• [Presentation] Crystal structure of zinc-finger domain of Nanos and its functional implications (2011)
  • Author(s): Hiroshi Hashimoto, Kodai Hara, Asami Hishiki, Shigeta Kawaguchi, Takuya Yoshizawa, Satoru Unzai, Yutaka Tamaru, Toshiyuki Shimizu, Mamoru Sato
  • Organizer: XXII Congress of the International Union of Crystallography
  • Place of Presentation: Palacio Municipal de Congresos de Madrid/Municipal Conference Centre
  • Year and Date: 20110822-20110830
• [Presentation] 制限酵素EcoO109IのDNA結合に関する構造研究 (2011)
  • Author(s): 渡部みなみ、橋本博、喜多恵子、清水敏之、佐藤衛
  • Organizer: 第28回PFシンポジウム
  • Place of Presentation: つくば国際会議場(エポカルつくば)
  • Year and Date: 20110712-20110713
• [Presentation] 腸炎ビブリオ由来耐熱性溶血毒TDHの構造 (2011)
  • Author(s): 橋本博、中平久美子、山根努、福井貴史、大西紀陽久、清水敏之、本田武司、佐藤衛、池口満徳、柳原格
  • Organizer: 第28回PFシンポジウム
  • Place of Presentation: つくば国際会議場(エポカルつくば)
  • Year and Date: 20110712-20110713
• [Presentation] 始原生殖細胞の形成に関わるNanosの構造生物学的研究 (2011)
  • Author(s): 橋本博、原幸大、菱木麻美、川口茂太、七條直記、中村敬至、雲財悟、田丸浩、清水敏之、佐藤衛
  • Organizer: 第28回PFシンポジウム
  • Place of Presentation: つくば国際会議場(エポカルつくば)
  • Year and Date: 20110712-20110713
• [Presentation] 始原生殖細胞の維持に関わるNanosの構造生物学的研究 (2011)
  • Author(s): 橋本博、原幸大、菱木麻美、川口茂太、吉澤拓也、雲財悟、田丸浩、清水敏之、佐藤衛
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク
  • Year and Date: 20110607-20110609
• [Presentation] 分子動力学シミュレーションによるK48およびK63結合型ジユビキチンの動的構造解析 (2011)
  • Author(s): 渕上壮太郎、笠口友隆、池口満徳、佐藤衛、木寺詔紀
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク
  • Year and Date: 20110607-20110609
• [Presentation] 天然変性タンパク質をターゲットとした新しい構造生物学-将来光源を用いた1分子解析を目指して- (2011)
  • Author(s): 佐藤衛
  • Organizer: PF研究会「ERLサイエンスワークショップII」
  • Place of Presentation: 高エネルギー加速器研究機構「小林ホール」(招待講演)
  • Year and Date: 20110427-20110428
• [Presentation] Structure of REV7 in complex with a REV3 fragment and structural implication of the interaction between DNA polymerase ζ and REV1 (2011)
  • Author(s): Hiroshi Hashimoto
  • Organizer: SNY-YCU Bilateral Symposium on Structural Biology
  • Place of Presentation: SNY-YCU Bilateral Symposium on Structural Biology
  • Year and Date: 2011-11-14
• [Presentation] 天然変性タンパク質をターゲットとした新しい構造生物学 (2011)
  • Author(s): 佐藤衛
  • Organizer: 京都大学大学院理学研究科講演会
  • Place of Presentation: 京都大学大学院理学研究科セミナーハウス(大セミナー室)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-07-28
• [Book] 翻訳後修飾のプロテオミクス(第4章:翻訳後修飾タンパク質の網羅的解析、4-13.脱イミノ化)平野久、大野茂男編集 (2011)
  • Author(s): 佐藤衛、萩原央記、明石知子
  • Total Pages: 234
  • Publisher: 講談社