2011 Fiscal Year Annual Research Report
ハブトビン組換え蛋白体の構造と抗血栓活性発現との関係性
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21390060
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
小杉 忠誠 琉球大学, その他部局等, 名誉教授 (80045517)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 真理子 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40180400)
砂川 昌範 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70325835)
上田 智之 琉球大学, 医学部, 准教授 (80160175)
江口 幸典 琉球大学, 医学部, 准教授 (50160354)
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| Keywords | ハブトビン / 組換え蛋白質 / 構造機能連関 / 抗血栓剤 / 抗血小板 |
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| Research Abstract |
断片化組換えハブトビン蛋白変異体habu-mut2(H-m2)、habu-mut3(H-m3)の追加大量精製を実施し、その蛋白変異体のもつ抗血栓作用を調査した。特に、血小板活性化抑制作用(凝集抑制作用)を追究するため、新しい研究方式フローサイトメトリー(FCM)を導入し、血小板活性化の抑制程度を客観的に解析した。さらに、ハブトビンの抗血小板凝集作用に関与する構造的部位の特徴も検討した。
１）ハブトビン蛋白変異体H-m2とH-m3 の血小板凝集抑制作用
家兎洗浄血小板(WP)を作製し、そのWPにPBS(コントロール)、H-m2およびH-m3を反応後、コラーゲンを添加した。WPのコラーゲン凝集において、H-m3は、コントロールに比して約20－30％抑制し、H-m2は約10％程度の抑制であった。したがって、H-m3とH-m2のアミノ酸配列上の違いが、血小板凝集抑制程度の違いに反映したものと推測される。
２）ハブトビン蛋白変異体H-m3の血小板活性化抑制作用
実験１）で、H-m3が血小板凝集を強く抑制することから、FCMを用いた血小板活性化抑制作用の検討実験にはH-m3のみを用いた。WPにPBS（コントロール)、H-m3を反応後、コラーゲンを添加した。その後、活性化血小板の膜上に出現するP-セレクチンと活性型GPIIb/IIIaをPE標識P-セレクチンとFITC標識PAC-1（活性型GPIIb/IIIa認識抗体）で検出し、血小板活性化程度をFCMで解析した。H-m3はコントロールに比して、活性型GPIIb/IIIaの出現を抑制したが、血小板と白血球が接するのに必要なP-セレクチンの出現は抑制されなかった。H-m3のアミノ酸配列上に、活性型GPIIb/IIIaの出現を抑制することで、血小板凝集抑制へ導く構造が存在すると示唆された。この成果を2013年国際生理学会に発表する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
23年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
23年度が最終年度であるため、記入しない。
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