2010 Fiscal Year Annual Research Report
パラフィン包埋切片を用いた遺伝子多重増幅と蛍光ビーズによる変異解析技術の開発
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21590411
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology |
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Principal Investigator |
細矢 博子 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 研究助手 (00158841)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 雅嗣 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 研究部長 (60155166)
西垣 裕 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 研究員 (80296988)
福 典之 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 研究員 (40392526)
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| Keywords | 病理解剖 / パラフィン包埋切片 / 生活習慣病 / 脳梗塞 / 動脈硬化 / 健康長寿 / ミトコンドリアゲノム多型 / 遺伝子増幅 |
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| Research Abstract |
脳梗塞・動脈硬化など生活習慣病に関連するミトコンドリアDNA多型を解明するために、剖検5164例のパラフィン包埋切片を切り出し、試料を調製した。切片作成ならびにDNA抽出の際に皮膚落屑物および唾液などが混入しないように適切な防止措置を講じた。パラフィン包埋組織切片からのDNA抽出には、古典的なフェノール/クロロフォルム法による抽出を試みたところ、良好な結果を得た。採用した方法の概要をここに記す。(1)パラフィン包埋検体1巻を2mLチューブに移す。(2)抽出用SDS Bufferを400μL添加。(3)100℃,10分加熱後、氷上で5分冷却→vortex。(4)SDS-Proteinase K溶液(抽出用SDS Buffer 100μL+14mg/mL Proteinase K 2μL)添加。(5)vortex後、55℃で3時間保温(6)フェノール/クロロフォルム処理。(7)クロロフォルム処理。(8)イソプロパノール沈殿(楽沈5μL添加)。(6)1/10TE30μlに溶解。パラフィン包埋組織切片から抽出したDNAを鋳型とする場合のPCRは増幅効率が低いので、プライマーの設定は増幅サイズが大きくなりすぎないよう注意した。従来使用していた28-plex PCRは、平均300bp(194-515bp)のDNA断片を増幅するものであったが、パラフィン包埋組織切片から抽出したDNAを鋳型とすると増幅が極めて不良であった。このため、プライマーの設定を全面的に変更し、24対のプライマーを用いて、より短い断片(100bp以下)を増幅した。検討の結果、50ngの総DNAから50回のPCRによって24本の断片を増幅可能であった。96例については凍結腎組織から抽出したDNAを用いて決定したミトコンドリアDNA多型解析の結果とパラフィン包埋切片から抽出したDNAを用いて得られた結果を照合し、信頼性を確認した。
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Research Products
(28 results)
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[Journal Article] Association of a polymorphism of BTN2A1 with dyslipidemia in East Asian populations2011
Author(s)
Tetsuo Fujimaki, Kimihiko Kato, Mitsutoshi Oguri, Tetsuro Yohida, Hideki Horibe, Kiyoshi Yokoi, Sachiro Watanabe, Kei Satoh, Yukitoshi Aoyagi, Masashi Tanaka, Hiroto Yoshida, Shoji Shinkai, Yoshinori Nozawa, Dong-Jik Shin, Jong-Ho Lee, Yangsoo Jang, Yoshiji Yamada
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Journal Title
Exp Ther Med
Volume: 2
Pages: 745-749
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Association of a polymorphism of BTN2A1 with myocardial infarction in East Asian populations2011
Author(s)
Yoshiji Yamada, Tamotsu Nishida, Sahoko Ichihara, Motoji Sawabe, Noriyuki Fuku, Yutaka Nishigaki, Yukitoshi Aoyagi, Masashi Tanaka, Yoshinori Fujiwara, Hiroto Yoshida, Shoji Shinkai, Kei Satoh, Kimihiko Kato, Tetsuo Fujimaki, Kiyoshi Yokoi, Mitsutoshi Oguri, Tetsuro Yoshida, Sachiro Watanabe, Yoshinori Nozawa, Aki Hasegawa, Toshio Kojima, Bok-Ghee Han, Younjin Ahn, Meehee Lee, Dong-Jik Shin, Jong Ho Lee, Yangsoo Jang
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Journal Title
Atherosclerosis
Volume: 215
Pages: 145-152
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Extensive screening system using suspension array technology to detect mitochondrial DNA point mutations2010
Author(s)
Nishigaki Y, Ueno H, Coku J, Koga Y, Fujii T, Sahashi K, Nakano K, Yoneda M, Nonaka M, Tang L, Liou CW, Paquis-Flucklinger V, Harigaya Y, Ibi T, Goto Y, Hosoya H, DiMauro S, Hirano M, Tanaka M
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Journal Title
Mitochondrion
Volume: 10
Pages: 300-308
DOI
Peer Reviewed
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