2010 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子増幅法を用いた超高感度生物発光イムノアッセイの開発
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21790042
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
大野 賢一 昭和大学, 薬学部, 助教 (20347272)
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| Keywords | イムノアッセイ / 遺伝子増幅法 / 生物発光検出 / 検査 / 診断 |
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| Research Abstract |
本研究ではイムノアッセイの超高感度化を目的として遺伝子増幅法の利用を検討する。その増幅法としてLAMP (Loop-mediated isothermal amplification)やRCA (Rolling Circle Amplification)と呼ばれる等温条件下で高効率なDNA増幅反応を検討し、ホタルルシフェリン-ルシフェラーゼ反応に基づく生物発光検出へと導く。
前年度に開発したLAMP-イムノアッセイに続き、本年度ではより緩和な条件で効率的にDNA伸長反応が進行するRCA法について検討した。まずDNA伸長反応の鋳型として使用する環状一本鎖DNAの調製法について検討した。PCRを利用して調製した一本鎖DNAの両端を連結するために、分子内ライゲーションを検討した。耐熱性リガーゼによる温度サイクルとパドロックプローブ法とを組み合わせて効率的な環状一本鎖DNAの調製に成功した。しかし、高効率なDNA増幅反応のためには高純度かつ高濃度の鋳型DNAが必要であることが明らかとなった。そこで、この一連の調製工程における反応収率と精製効率の向上について検討した。反応条件や洗浄操作などの精製法について丹念に検討して調製法を最適化した。
またその他の方法として、短鎖(50-mer)の一本鎖DNAを原料にして分子間ライゲーション及びそれに引き続く分子内ライゲーション反応による環状一本鎖DNAの調製を試みた。しかしこの方法では複雑な反応の制御が非常に困難であることから、効率的な環状一本鎖DNAの調製には至っていない。
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Research Products
(1 results)
