2021 Fiscal Year Annual Research Report
可逆的ナノ粒子集積を用いたタンパク質の超マルチカラー・高感度イメージング基盤
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21H01722
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
太田 誠一 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 准教授 (40723284)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 蛍光ナノ粒子 / 集積体 / 超マルチカラーイメージング / 画像診断 / バイオマーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、一本鎖DNAを修飾した抗体と蛍光ナノ粒子、そしてリンカーDNAをビルディングブロックとして用いる。まず、DNA修飾抗体で細胞膜上の標的タンパク質を標識する。続いて、抗体、ナノ粒子に修飾されたDNAと相補的な配列を持つ一本鎖DNAをリンカーとして用いて、二重らせん形成を利用して抗体と蛍光ナノ粒子を結合させる。これを起点とし、リンカーDNAを用いたナノ粒子集積を繰り返すことで、蛍光シグナルを増幅していく。
今年度の検討において、ビルディングブロックとして用いる有機半導体ポリマー蛍光ナノ粒子(Pdot)の合成及びサイズ制御手法を確立した。THF中に有機半導体高分子であるF8BT及び分散安定剤であるスチレン/無水マレイン酸共重合体(PSMA)を溶解し、超音波照射下で純水中に滴下することで、Pdotを合成した。貧溶媒である純水中でF8BTが核発生した後、PSMA中の無水マレイン酸が加水分解して親水化することで粒子表面が保護され、核成長が停止する。この際、溶媒のpHによってこの加水分解速度が変化することに着目し、適切なイオン濃度下でPHを変化させることで、合成される粒子径を20～数百nmの範囲で任意に制御することが可能となった。
続けて、末端をアミン化した一本鎖DNA及びPEGと粒子表面のカルボキシ基とをカルボジイミド反応で結合させることで、Pdot表面にDNAを修飾した。DNAの二重らせん形成を利用した集積化では高塩濃度が必要となり、この環境下で粒子の分散安定性を維持する必要がある。DNAとPEGの混合比及び修飾密度を変化させて実験を行った結果、ハイブリダイゼーション条件下でも凝集しない修飾条件を見出すことができた。さらに、モデル細胞として金ナノ粒子を用い、得られたDNA修飾PdotをリンカーDNAと共に加えた結果、金ナノ粒子表面にPdotが集積されていることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の検討で、本研究で開発を目指す超マルチカラーイメージング用ラベルのビルディングブロックとなる有機半導体ポリマー蛍光ナノ粒子(Pdot)の合成・サイズ制御手法、及び粒子表面への一本鎖DNAの修飾方法を確立し、一段階の粒子集積を確認することができた。よって研究は、順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度はまず、一本鎖DNA修飾Pdotを用いた多段階の集積化を検討する。一本鎖DNA修飾有機半導体ポリマー蛍光ナノ粒子に対して、リンカーDNAと、対となるナノ粒子を逐次加えていくことで、相補的な配列同士の二重らせん形成により多段階の集積化が可能となるか、検証を行う。さらに集積化に伴う蛍光強度の上昇を、蛍光光度計によって測定する。これに加え、抗体に対する一本鎖DNAの修飾、及びこれを標的とした一本鎖DNA修飾Pdotの結合についても、検証を行う。一本鎖DNA修飾を施した抗体を培養細胞に加え、これに対しさらに相補的な配列を持つ一本鎖DNA修飾Pdotを加えることで、細胞膜表面のタンパク質マーカーを蛍光標識する。蛍光標識の評価は、共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察によって行う。
本研究では、上記の高輝度観察の後に標的の蛍光をOFFとすることで、同じ色を用いて新たに他の標的をラベリングできるようにすることを計画している。これをm色のラベルでn回繰り返すことで、m×n色の超マルチカラーイメージングの実現を目指す。観察後のPdotの遊離には、Toehold Displacement法と呼ばれる、DNAの二重らせんの組み換え反応を用いる。抗体とPdotとの間のリンカーにミスマッチ領域を導入しておき、リンカーと完全に相補的な配列を持ったDNA(切り離し配列)を加えると、Toehold Displacementによる二重らせんの組み換えが起こり、粒子集積体を抗体から切り離すことができる。このPdotの切り離しについても、2022年度に検討を始める予定である。
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