2022 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis of activation of a novel tumor progression signaling involving Wnt signaling proteins and supression by antibodies.
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21H02420
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
柴田 直樹 兵庫県立大学, 理学研究科, 准教授 (30295753)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 構造生物学 / Wntシグナル伝達経路 / 結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / 癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
R4年度は，研究計画調書に記した４項目のうち主に以下の３項目，① CKAP4-DKK複合体の構造解析，② CKAP4細胞外領域全体の構造解析，③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析について研究を遂行した。以下にこれまでの結果について概要を示す。
① CKAP4とDKK cysteine rich domain (DKK_CRD1)試料をそれぞれ別々に調製したものを混合し結晶化スクリーニングキットを用いて結晶化条件の検討を行ったところ，１条件において結晶が得られた。
② CKAP4細胞外領域（128-602）のうち，431-602の領域について新たに発現系を構築し，結晶を得ることができた。放射光施設において回折実験を行ったところ，約 4オングストローム分解能のデータを得ることに成功した。
③ ４種類の抗CKAP4モノクローナル抗体のFabフラグメントとCKAP4細胞外領域との複合体を調製した。結晶化スクリーニングを行うために十分な量の複合体試料を得ることが困難であったため，結晶構造解析法よりも少量での構造解析が可能なクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して測定を行った。その結果，ほとんどの粒子がグリッド上で気液界面に集合していることが判明した。得られた画像データから単粒子解析を行ったが，明瞭な三次元再構成像を得ることが困難であった。二次元でのクラスタリングではCKAP4-Fab複合体と思われる像が得られたため，グリッド作成法の検討により明瞭な三次元再構成像を得ることは可能であると思われる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①~③の各項目について，現時点における研究全体に対する達成度は以下の通りである。
① CKAP4-DKK複合体の構造解析（60%）
② CKAP4細胞外領域全体の構造解明（80%）
③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析 (50%)
以上を総合すると60%以上まで到達しており，全体的には概ね計画通りに進行していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
①～③の各項目について，研究の進捗状況をふまえ，以下の方針で研究を進めていく。
①当該年度中にDKK-CRD1ドメインとCKAP4細胞外領域の複合体の結晶が得られたので，放射光施設においてX線回折データ測定し，DKK-CKAP4複合体の立体構造解析を行う。一方で，得られた結晶からは中～高分解能のX線回折データを得ることが困難な場合を想定し，引き続いてクライオ電子顕微鏡による単粒子解析も並行して実施する。これによってDKKとCKAP4の相互作用について詳細を明らかにし，LRP5/6を含めた三者複合体モデルを構築する。
②CKAP4細胞外領域の構造解析はほぼ完了したが，まだ側鎖の構造が不明な領域があるため，引き続き結晶化条件の改良に取り組む。
③当該年度末までに４種類の抗CKAP4モノクローナル抗体のFabフラグメントとCKAP4細胞外領域との複合体を調製した。結晶化スクリーニングを行うために十分な量の複合体試料を得ることが困難なため，結晶構造解析法よりも少量での構造解析が可能なクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して測定を行った。その結果，ほとんどの粒子がグリッド上で気液界面に集合していることが判明した。得られた画像データから単粒子解析を行ったが，明瞭な三次元再構成像を得ることが困難であった。次年度は界面活性剤を用いて粒子を液相全体に分散させることにより，高分解能での三次元再構成像を得ることを目指す。
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[Journal Article] X-ray crystallographic and mutational analysis of the NylC precursor: catalytic mechanism of autocleavage and substrate hydrolysis of nylon hydrolase2022
Author(s)
Negoro, S., Shibata, N., Kato, D., Tanaka, Y., Yasuhira, K., Nagai, K., Oshima, S., Furuno, Y., Yokoyama, R., Miyazaki, K., Takeo, M., Hengphasatporn, K., Shigeta, Y., Lee, Y., Higuchi, Y.
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Journal Title
FEBS J.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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