Single cell analysis of TCR genotypes of CTL at recovery phase of acute Dengue infection

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H02969
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 平山 謙二 長崎大学, 熱帯医学・グローバルヘルス研究科, 教授 (60189868)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水上 修作 長崎大学, 熱帯医学研究所, 准教授 (00508971) ; グエン フイティエン 長崎大学, 熱帯医学・グローバルヘルス研究科, 准教授 (20457526) ; 谷本 幸介 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教 (60611613)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: デング熱 / T細胞レセプター遺伝子 / 細胞障害性T細胞 / エフェクター細胞 / メモリー細胞 / T細胞受容体 / シングルセル解析 / 急性期

Outline of Annual Research Achievements

令和３年４月に開始した本研究は、以下の２つのステップで進める計画であった。 １．デング熱患者の採血と末梢血リンパ球分離・保存（令和３年） ２．分離したリンパ球のシングルセルｍRNA発現解析（令和４－５年） 採血の開始は当初の予定よりも大幅に遅れたが、その大きな理由はマニラでの新型コロナの大流行とロックダウンの長期化であった。令和４年度にマニラの研究所の附属病院で最初の患者の採血が行われ、最終的には令和５年度のはじめまでに予定していた採血と細胞の保存が完了した。この遅れに伴い、当初令和４年に予定していたシングルセル解析が令和５年度に繰り越されることになり、すべての血液ドナーの臨床データの確認作業やHLA-A,B,C,DRアリルタイピング等の予備実験も含め令和５年度の前半までかかって、当初の予定分の作業を完了した。１５名の採血から、HLA型や重症化の有無などを考慮して厳選した４名の患者の、急性期から回復期の３回の時点での末梢血リンパ球中のCD8陽性細胞障害性T細胞のシングルセル分析のための発現ｍRNAの３種の解析用ｃDNAライブラリーの作製（ｍRNA発現解析用、TCR配列解析用、表面抗原発現解析用）に成功し、共同研究先の大阪大学免疫フロンティア研究センターでのNGS解析に供することができ、通常のクロノタイプ解析に必要な情報を得ることができていることを確認することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画に遅れを生じた原因は、まず新型コロナのパンデミックによるデング熱の患者の極度の減少があげられ、これによる令和３年の遅れを引きずって、令和４年のデング熱の患者の採血計画も半年以上遅れることになった。また一回の必要な採血量が６ｍｌと多量なため、若年の小児には拒否されることが多かった。それにより最終的に必要と考えられるボランティア数に達するのに１年以上かかったのが最終的にシングルセル解析の実施を令和５年度にずれ込ませることになった。

Strategy for Future Research Activity

コロナなどの外的な要因がなくとも、研究計画自体が暗中模索の中で作成したもので、しかも非常に高額な試薬をワンチャンスで使用せざるを得ないような条件は、極度の緊張を強いられるものであった。しかしその一回のチャンスで、限られた血液ドナーのリンパ球を使って、まさしくシングルセル解析でなければ得られない貴重な情報が得られたと思っている、いよいよ最終的な解析結果の解釈を行うにあたり、これまでがん研究などから得られた関連するビッグデータを参考に、大阪大学の免疫フロンティアの専門家の協力も得つつ、デング熱のウイルス排除に有効な細胞障害性T細胞のエピトープ解析へと研究を推進していきたいと考えている。