初期分泌経路における亜鉛恒常性維持とタンパク質恒常性維持の相関と分子構造基盤

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H04758
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 稲葉 謙次 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (10423039)
• Project Period (FY): 2021-04-05 – 2024-03-31
• Keywords: 亜鉛 / クライオ電子顕微鏡 / 細胞イメージング / タンパク質品質管理 / ケミカルバイオロジー

Outline of Annual Research Achievements

ゴルジ体の亜鉛恒常性維持機構の詳細を解析するため、ゴルジ体に存在する亜鉛輸送体ZnT4, 5/6, 7をそれぞれノックダウンした条件で、我々が新規に開発したサブオルガネラターゲット型亜鉛蛍光プローブを利用し、シス、メディアル、トランスゴルジ槽それぞれの亜鉛濃度を定量解析した。さらにそれぞれの亜鉛輸送体のゴルジ体内での局在を解析するため、超解像顕微鏡による観察を行った。以上の結果、ZnT4, 5/6, 7によるゴルジ体の亜鉛恒常性維持機構に関する重要な知見を得た。本結果をまとめ論文投稿を行い、現在は論文リバイス中である。さらに、ZnT4, 5/6, 7ノックダウン時の分泌タンパク質の生合成量の網羅的定量解析を行うことでゴルジ体内亜鉛依存的に生合成量が有意に変化する重要タンパク質を幾つか同定しており、現在そのメカニズム解明を進めている。

さらにシスゴルジ槽への亜鉛取り込み、および亜鉛依存シャペロンERp44の機能制御に関わるZnT7について、クライオ電子顕微鏡による構造解析を進め、inward facing form, outward facing form共に2.8Å分解能で構造決定した。これによりZnT7による亜鉛輸送メカニズムの理解が大きく進み、現在論文投稿に向け、構造情報に基づく機能データを取得中である。特に、ZnT7に特徴的な長いヒスチジンリッチループの機能的役割に着目し、そのループ領域欠失変異体の構造と活性を解析中である。以上のデータを統合し、2022年度前半に論文を投稿予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2021年度の主要課題として挙げていた、ゴルジ体に存在する亜鉛輸送体による亜鉛恒常性維持機構の系統的解析を一通り終え、予定通り論文投稿を行った。さらに、各亜鉛輸送体ノックダウン時のプロテオーム解析も当初計画した通りに進んでいる。

亜鉛輸送体の構造解析についても、ZnT7の種々の反応中間状態についてクライオ電顕による解析が進み、その亜鉛輸送メカニズムの詳細が明らかとなった。ZnT7のクライオ電顕構造に関する論文についても、2022年度前半には投稿できる見込みであり、進捗状況に問題はない。

Strategy for Future Research Activity

ゴルジ体には亜鉛イオンを取り込むZnT4,5/6,7に加え、亜鉛イオンを排出するZIP9/11/13が存在する。ZnT4,5/6,7の機能解析については、2021年度におよそ完了したため、今後はZIP9/11/13の機能的役割を系統的かつ定量的に解析する必要がある。これにより、ゴルジ体における亜鉛恒常性維持機構の全容解明を目指す。

さらに、ZnT7の高分解能構造解析を達成したため、次は構造情報に基づく生化学機能解析ならびに阻害剤の開発を行う。ZnT7のクライオ電顕による構造解析に関する論文を一日も早く完成させ、2022年度中の論文受理を目指す。さらにZnT7の阻害剤開発を進め、これにより、ゴルジ体内の亜鉛濃度を低下させた条件でプロテオーム解析を行い、亜鉛恒常性維持とタンパク質恒常性維持の相関に関する重要な知見を集める予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] San Raffaele Scientific Institute(イタリア)
  • Country Name: ITALY
  • Counterpart Institution: San Raffaele Scientific Institute
• [Int'l Joint Research] KBSI(韓国)
  • Country Name: KOREA (REP. OF KOREA)
  • Counterpart Institution: KBSI
• [Journal Article] Functional Interplay between P5 and PDI/ERp72 to Drive Protein Folding (2021)
  • Author(s): Matsusaki Motonori、Okada Rina、Tanikawa Yuya、Kanemura Shingo、Ito Dai、Lin Yuxi、Watabe Mai、Yamaguchi Hiroshi、Saio Tomohide、Lee Young-Ho、Inaba Kenji、Okumura Masaki
  • Journal Title: Biology Volume: 10 Pages: 1112～1112
  • DOI: 10.3390/biology10111112
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Ca2+ Regulates ERp57-Calnexin Complex Formation (2021)
  • Author(s): Tanikawa Yuya、Kanemura Shingo、Ito Dai、Lin Yuxi、Matsusaki Motonori、Kuroki Kimiko、Yamaguchi Hiroshi、Maenaka Katsumi、Lee Young-Ho、Inaba Kenji、Okumura Masaki
  • Journal Title: Molecules Volume: 26 Pages: 2853～2853
  • DOI: 10.3390/molecules26102853
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A unique leucine-valine adhesive motif supports structure and function of protein disulfide isomerase P5 via dimerization (2021)
  • Author(s): Okumura Masaki、Kanemura Shingo、Matsusaki Motonori、Kinoshita Misaki、Saio Tomohide、Ito Dai、Hirayama Chihiro、Kumeta Hiroyuki、Watabe Mai、Amagai Yuta、Lee Young-Ho、Akiyama Shuji、Inaba Kenji
  • Journal Title: Structure Volume: 29 Pages: 1357～1370.e6
  • DOI: 10.1016/j.str.2021.03.016
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Distinct roles and actions of protein disulfide isomerase family enzymes in catalysis of nascent-chain disulfide bond formation (2021)
  • Author(s): Hirayama Chihiro、Machida Kodai、Noi Kentaro、Murakawa Tadayoshi、Okumura Masaki、Ogura Teru、Imataka Hiroaki、Inaba Kenji
  • Journal Title: iScience Volume: 24 Pages: 102296～102296
  • DOI: 10.1016/j.isci.2021.102296
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cryo‐EM analysis provides new mechanistic insight into ATP binding to Ca ²⁺ ‐ATPase SERCA2b (2021)
  • Author(s): Zhang Yuxia、Watanabe Satoshi、Tsutsumi Akihisa、Kadokura Hiroshi、Kikkawa Masahide、Inaba Kenji
  • Journal Title: The EMBO Journal Volume: 40 Pages: e108482
  • DOI: 10.15252/embj.2021108482
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Visualization of structural dynamics of protein disulfide isomerase enzymes in catalysis of oxidative folding and reductive unfolding (2021)
  • Author(s): Okumura Masaki、Noi Kentaro、Inaba Kenji
  • Journal Title: Current Opinion in Structural Biology Volume: 66 Pages: 49～57
  • DOI: 10.1016/j.sbi.2020.10.004
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Structural and mechanistic basis of protein quality control systems in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus of human cells (2021)
  • Author(s): Inaba, K.
  • Organizer: UST Global mentoring program meeting
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Observing the cotranslational disulfide rearrangement in a cell surface multidomain protein, LDL receptor, in the ER of mammalian cells (2021)
  • Author(s): Kadokura, H., Dazai, Y., Fukuda, Y., Hirai, N., Nakamura, O., and Inaba, K.
  • Organizer: Functional Disulfides in Health & Disease
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 初期分泌経路における亜鉛イオンに依存したタンパク質品質管理機構の分子構造基盤 (2021)
  • Author(s): 稲葉 謙次
  • Organizer: 第５８回日本生化学会北海道支部会
  • Invited
• [Presentation] X線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡単粒子解析がもたらす知見の対比：小胞体カルシウムポンプSERCA2bを例に (2021)
  • Author(s): 稲葉 謙次
  • Organizer: 第一回生命金属科学地方巡業
  • Invited
• [Presentation] 初期分泌経路における亜鉛イオンに依存したタンパク質品質管理機構の分子構造基盤 (2021)
  • Author(s): 稲葉 謙次
  • Organizer: 学術変革領域B「遅延制御超分子化学」 キックオフシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 哺乳動物細胞分泌経路における亜鉛調節とタンパク質品質管理 (2021)
  • Author(s): 天貝佑太、山田桃、渡邊朝美、小和田俊行、楢本悟史、渡部聡、経塚淳子、Roberto Sitia、水上進、稲葉謙次
  • Organizer: 第62回 日本植物生理学会年会
• [Presentation] 亜鉛に依存したERp44-クライアント複合体の解離機構の解明 (2021)
  • Author(s): 渡部 聡 三宅杏美子 天貝佑太 稲葉謙次
  • Organizer: 第21回蛋白質科学会年会
• [Presentation] 初期分泌経路における亜鉛濃度制御が小胞体―ゴルジ体シャペロンERp44の機能をコントロールする (2021)
  • Author(s): 天貝佑太、山田桃、渡邊朝美、小和田俊行、楢本悟史、渡部聡、経塚淳子、Roberto Sitia、水上進、稲葉謙次
  • Organizer: 第21回 日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Mechanisms of ER-associated degradation pathway mediated by the cooperation of ERdj5 and BiP (2021)
  • Author(s): Cai, X., Ito, S., Noi, K., Inoue, M., Ushioda, R., Nagata, K., and Inaba, K.
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Elucidating the in vivo oxidative folding mechanism (2021)
  • Author(s): 金村進吾, 奥村正樹, 稲葉謙次
  • Organizer: 第21回 日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] 細胞内で翻訳合成途上のLDL受容体にジスルフィド結合が形成される仕組み (2021)
  • Author(s): 門倉 広，平井直也，福田 洋，太宰 結，稲葉謙次
  • Organizer: 第94回日本生化学大会
• [Presentation] Correlative structural analysis of a full-length cargo receptor ERGIC-53 in complex with its partner MCFD2 (2021)
  • Author(s): Watanabe, S., Kise, Y., Yonezawa, K., Shimizu, N., Nureki, O. and Inaba, K.
  • Organizer: 第59回生物物理学会年会
• [Presentation] Cryo-EM analysis provides new mechanistic insight into ATP binding to Ca2+-ATPase SERCA2b (2021)
  • Author(s): Zhang, Y., Watanabe, S., Tsutsumi, A., Kadokura, H., Kikkawa, M., and Inaba, K.
  • Organizer: 第59回日本生物物理年会
• [Presentation] Cryo-EM structure analysis of Secretory Pathway Calcium/Manganese ATPase 1 (SPCA1) (2021)
  • Author(s): Chen, Z., Watanabe, S., Hashida, H., Inoue, M., Tsutsumi, A., Kikkawa, M. and Inaba, K.
  • Organizer: 第59回日本生物物理年会
• [Presentation] ZIP7 regulates the physiological function of ERp44 (2021)
  • Author(s): Arai, C., Amagai, Y., Inaba, K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 全長カーゴ受容体ERGIC-53と補助因子MCFD2との複合体のクライオ電顕構造 (2021)
  • Author(s): 渡部 聡、木瀬孔明、米澤健人、清水伸隆、濡木理、稲葉謙次
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Cryo-EM analysis provides new mechanistic insight into ATP binding to Ca2+-ATPase SERCA2b (2021)
  • Author(s): Zhang, Y., Watanabe, S., Tsutsumi, A., Kadokura, H., Kikkawa, M., and Inaba, K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Mechanisms of ER-associated degradation pathway mediated by the cooperation of ERdj5 and BiP (2021)
  • Author(s): Cai, X., Ito, S., Noi, K., Inoue, M., Ushioda, R., Nagata, K., and Inaba, K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 亜鉛輸送体によって制御されるERp44の小胞体―ゴルジ体輸送 (2021)
  • Author(s): 天貝佑太、稲葉謙次
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Cryo-EM structures of human zinc transporter ZNT7 reveal the mechanism of Zn2+ uptake from the cytosol into the Golgi apparatus (2021)
  • Author(s): Bui, B. H., Watanabe, S., Nomura, N., Iwata, S., Tsutsumi, A., Kikkawa, M., and Inaba K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 亜鉛結合性シャペロンERp44-基質複合体の形成・解離機構の解明とクライオ電顕構造 (2021)
  • Author(s): 木谷美思、渡部聡、天貝佑太、稲葉謙次
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] ヒト細胞小胞体関連機能の変化を検出するための鋭敏で簡便なレポーターの開発と機能評価 (2021)
  • Author(s): 原田楠子, 八巻 聡, 平井直也, 中村大祐, 河野憲二, 稲葉謙次, 門倉 広
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Structural analysis of Secretory Pathway Calcium/Manganese ATPase 1 (SPCA1) (2021)
  • Author(s): Chen, Z., Watanabe, S., Hashida, H., Inoue, M., Tsutsumi, A., Kikkawa, M., and Inaba, K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] PDIファミリータンパク質PDIRの構造機能解析 (2021)
  • Author(s): 東晃太、松崎元紀、渡部聡、稲葉謙次
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Remarks] 稲葉研究室ホームページ
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/inaba/html/
• [Remarks] 東北大学生命科学研究科生体分子構造分野
  • URL: https://www.lifesci.tohoku.ac.jp/research/fields/laboratory.html?id=2524
• [Patent(Industrial Property Rights)] タンパク質のフォールディング剤 (2021)
  • Inventor(s): 奥村 正樹、村岡 貴博、岡田 隼輔、稲葉 謙次、松﨑 元紀
  • Industrial Property Rights Holder: 奥村 正樹、村岡 貴博、岡田 隼輔、稲葉 謙次、松﨑 元紀
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2021-033583