2021 Fiscal Year Annual Research Report
ほ乳類性決定遺伝子Sryの作用機序とそのゲノム進化過程の抜本的な見直し
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21H04769
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
立花 誠 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (80303915)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮脇 慎吾 岐阜大学, 応用生物科学部, 助教 (70756759)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2024-03-31
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| Keywords | 性決定因子 / タンパク質分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
雌雄への分化（性分化）は、有性生殖をおこなう生物に必須の生命現象である。ほ乳類では、性決定遺伝子であるSryが胎仔期の生殖腺の体細胞で一過性に発現し、それまで性的に未分化な生殖腺をオス化（精巣化）する。私たちは2020年に、マウスの性決定遺伝子Sryにはこれまで見つかっていなかった第2エキソンが存在していること、また、この新規のエキソンが存在することにより、Sry遺伝子座は新規のSRYタンパク質であるSRY-Tをコードしていることを明らかにした。SRY-Tはタンパク質分解を受けないため、マウスの生体内で実質的に機能している真の性決定因子であった。一方で既知の単一エキソン型翻訳産物であるSRY-Sは、C末端にタンパク質分解モチーフ（デグロン）を有しているため、機能不全型の性決定因子であることが分かった（Science 2020）。これらの発見に基づき、機能不全型の性決定因子であるSRY-Sのタンパク質分解メカニズムを解明する研究を進めた。
SRY-Sのデグロン配列であるS18アミノ酸をEGFPのC末端に融合したタンパク質（EGFP-S18）を発現する細胞株を用い、CRISPR-KOスクリーニングを行った。gRNAライブラリを感染後、EGFP強陽性細胞群をフローサイトメーターによって分取した。EGFP強陽性細胞におけるgRNAの分布を感染前の細胞と比較したところ、HECTファミリーのユビキチンE3リガーゼの一種が優位に濃縮されていることを見出した。実際にEGFP-S18を発現する細胞株でこのユビキチンE3リガーゼを欠損させると、EGFPの蛍光強度が10倍ほど上昇することが明らかになった。この結果は、SRY-SはHECTファミリーのユビキチンE3リガーゼによってタンパク質分解を受ける可能性を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR-KOスクリーニングによる遺伝子の同定法は、細胞ひとつに付き1遺伝子しかノックアウトできないという性質がある。このため、ある経路に複数の遺伝子がredundantに効いているような状況では、CRISPR-KOによるスクリーニング系は適切ではない。今回の私たちのスクリーニングでは、EGFP-S18のタンパク質分解を促すユビキチンE3リガーゼの候補として、HECTファミリーに属する酵素がひとつだけ浮かび上がった。さらにEGFP-S18を発現する細胞株を用いて検証したところ、本E3リガーゼを欠損させるとEGFPの蛍光強度が優位に上昇することが分かった。これらの研究成果は、EGFP-S18のタンパク質分解を促すユビキチンE3リガーゼを同定するための実験が、CRISPR-KOスクリーニングによって首尾よく達成されたことを意味している。よって「（２）おおむね順調に進展している」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、令和3年度に同定された分解型性決定因子SRY-SのユビキチンE3リガーゼの候補分子について、その生体内での機能を明らかにする。まずはマウス受精卵を使った通常のCRISPRノックアウト法により、当該E3リガーゼの遺伝子をを欠損させたマウスを作出する。当該E3リガーゼの欠損マウスが成体まで成長可能であった場合は、Sryの第2エキソンを欠損したマウスと交配し、Sry-ex2-KO; E3 ligase-KOマウスを作出する。XY, Sry-ex2-KOマウスにおけるオスからメスへの性転換の表現型が、当該E3リガーゼの欠損によってレスキューされるかどうか（オスとして発生するかどうか）について検証する。もしもE3リガーゼ欠損マウスが胎仔期に致死であった場合には、Cre-loxPシステムの導入による当該E3リガーゼの条件的欠損マウスを樹立する。その際のCreドライバーには、当研究室で樹立したSF1-Creマウスを使用する。
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[Journal Article] Dynamic erectile responses of a novel penile organ model utilizing two photon excitation microscopy (TPEM)†2021
Author(s)
Daiki Hashimoto, Tsuyoshi Hirashima, Hisao Yamamura, Tomoya Kataoka, Kota Fujimoto, Taiju Hyuga, Atsushi Yoshiki, Kazunori Kimura, Shunsuke Kuroki, Makoto Tachibana, Kentaro Suzuki, Nobuhiko Yamamoto, Shin Morioka, Takehiko Sasaki, Gen Yamada
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Journal Title
Biology of Reproduction
Volume: 104
Pages: 875, 886
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Meiosis-specific ZFP541 repressor complex promotes developmental progression of meiotic prophase towards completion during mouse spermatogenesis.2021
Author(s)
Yuki Takada, Chisato Kodera, Kazumasa takemoto, Akihiko Sakashita, Kenichi Horisawa, Ryo Maeda, Ryuki Shimada, Shingo Usuki, Sayoko Fujimura, Naoki Tani, Kumi Matsuura, Tomohiko Akiyama, Atsushi Suzuki, Hitoshi Niwa, Makoto Tachibana, Takeshi Ohba, Hidetaka Katabuchi, Satoshi Namekawa, kimi Araki, Kei-Ichiro Ishiguro
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 12
Pages: e3184
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells2021
Author(s)
Takeshi Yoshino, Takahiro Suzuki, Go Nagamatsu, Haruka Yabukami, Mika Ikegaya, Mami Kishima, Haruka Kita, Takuya Imamura, Kinichi Nakashima, Ryuichi Nishinakamura, Makoto Tachibana, Miki Inoue, Yuichi Shima, Ken-Ichirou Morohashi, Katsuhiko Hayashi K
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Journal Title
Science
Volume: 373
Pages: 282, 289
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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